وضع نموذج الإكلينيكية البشرية من أوستيوكلاستوجينيسيس من الدم المحيطية وحيدات مثقف يشترك مع خطوط خلايا سرطان الثدي

ويصف هذا البروتوكول وضع في المختبر البشري السريري نموذج من أوستيوكلاستوجينيسيس من الدم المحيطية وحيدات مثقف مع خطوط خلايا سرطان الثدي لمحاكاة التفاعل اوستيوكلاست خلايا السرطان. يمكن استخدام النموذج زيادة فهمنا لتكوين ورم خبيث العظام وتحسين الخيارات العلاجية.

الهدف العام من هذا النموذج قبل السريري البشري في المختبر لتكوين العظم المشتق من خلايا الدم المحيطية ، أو PBMCs ، المزروعة بخطوط خلايا سرطان الثدي هو تقليد تفاعلات ناقضات العظم في الخلايا السرطانية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال ورم خبيث في العظام حول تأثيرات تفاعل الخلايا السرطانية والخلايا العظمية داخل البيئة المكروية للعظام. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها نموذج بشري بالكامل قبل السريري.

أيضا ، يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على ورم خبيث في العظام. يمكن تطبيقه أيضا على دراسة الآليات المرضية الأخرى المتعلقة بالعظام ، مثل هشاشة العظام. قد يعاني الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب التباين بين المتبرعين الأصحاء وفي اختيار كثافة خلايا PBMC المناسبة.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأنهم بحاجة إلى رؤية خطوات اختيار PBMC والبذر الخاصة بنا تتطلب بعض الخبرة اليدوية قبل تحقيق الكفاءة. ابدأ بتخفيف ما لا يقل عن 20 مل من الدم الكامل للمتبرع الأصحاء في EDTA بنسبة واحد إلى واحد في PBS. بعد الخلط جيدا ، قسم محلول الدم إلى 30 مليلتر في أنابيب مخروطية سعة 50 مل.

بعناية 15 مل من وسط فصل الخلايا الليمفاوية في قاع كل أنبوب. افصل الخلايا عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة. واسحب الخلية البيضاء أحادية النواة التي تحتوي على معاطف مصفاة إلى أنبوب جديد سعة 15 مل.

اغسل الخلايا المحصودة مرتين في 20 مل من PBS لكل غسلة ، متبوعا بتحلل خلايا الدم الحمراء بخمسة ملليلتر من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء لمدة ثلاث إلى خمس دقائق ، على الثلج. أوقف التفاعل ب 20 مل من PBS ، واجمع خلايا الدم البيضاء عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات وأكمل ألفا إم إم للعد.

بعد ذلك ، قم بوضع الخلايا عند سبع نقاط خمسة في 10 إلى خمسة PBMC لكل سنتيمتر مربع في كل بئر من صفيحة 24 بئرا لحضانة 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة ثاني أكسيد الكربون2. بعد حوالي ثلاث ساعات ، قم بإزالة المادة الطافية والحطام والخلايا غير المرتبطة وكريات الدم الحمراء غير المتحللة من الثقافات. وأضف وسيطا طازجا ، مكملا ب MCSF.

بعد أربعة عشر يوما من البذر ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS ، وثبتها في أربعة بالمائة بارافورمالدهيد لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإجراء تلطيخ المصيدة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ستكون الخلايا الشبيهة بناقضات العظم إيجابية TRAP مع أربع نوى على الأقل.

عد الخلايا الشبيهة بناقضات العظم يدويا تحت المجهر بتكبير 10 أضعاف. بالنسبة لتمايز ناقضات العظم التي تسببها الخلايا السرطانية عندما تصل الخلايا السرطانية إلى التقاء تسعين بالمائة ، يتم فصلها عن طريق التربسين ويتم زرعها في إدخالات مسام بمقدار أربعة ميكرومتر عند أربعة أضعاف 10 إلى ثلاث خلايا لكل سنتيمتر مربع تركيز في ألفا MEM الطازج. في اليوم التالي ، ضع الإدخالات المصنفة فوق مزارع الخلايا أحادية النواة المطلية غير المتمايزة ليوم واحد في ALPHA M-E-M الكامل ، وقم بتغيير الوسط كل يومين إلى ثلاثة أيام.

بعد ذلك ، بعد 11 يوما من بدء الزراعة المشتركة ، قم بنقل الإدخالات إلى صفيحة جديدة تحتوي على الكاشف المناسب لتحليل المصب المطلوب. يمكن لخلايا سرطان الثدي أن تحافظ على تكوين العظم ، حيث أن عدد ناقضات العظم في الآبار التي تسببها الخلايا السرطانية مشابه لتلك التي يتم الحصول عليها في آبار التحكم في عامل النمو الإيجابي. ومع ذلك ، يتم تقليل عدد ناقضات العظم التي لوحظت في جميع الثقافات ، عندما يتم علاج الخلايا بدواء مضاد للورم.

ومن المثير للاهتمام أن المساحات السطحية لناقضات العظم الناضجة المشتقة من عوامل النمو أكبر من تلك التي تسببها الخلايا السرطانية. لا يلاحظ هذا التأثير في الثقافات المعالجة بالأدوية المضادة للأورام. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في سبع وثماني ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء تحليل إضافي للمصب مثل تحليل التعبير الجيني ، أو Western Blot ، أو تحليل التألق المناعي ، أو ELISA للإجابة على أسئلة إضافية حول تفاعلات الخلايا السرطانية / الخلايا العظمية أو حول آليات الأدوية المضادة للورم. بعد تطويرها ، تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال ورم خبيث في العظام لدراسة البيئة الدقيقة للعظام ، في نموذج قبل السريري البشري بالكامل. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الزراعة المشتركة للخلايا الوحيدة ، والخضوع للتمايز مع الخلايا السرطانية.

لا تنس أن العمل مع العينات البيولوجية والأدوية يمكن أن يكون خطيرا للغاية وأنه يجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات ومعاطف المختبر أثناء تنفيذ هذا الإجراء.