إيمونوستينينج لإدخال تعديلات على الحمض النووي: التحليل الحسابي للصور [كنفوكل]

المكتشفة حديثا المؤكسد أشكال 5-ميثيلسيتوسيني (أوكسي-mCs)، 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني (5hmC)، 5-فورميلسيتوسيني (إف سي 5) و 5-كاربوكسيلسيتوسيني (5caC) قد تمثل تعديلات الحمض النووي متميزة مع أدوار وظيفية فريدة من نوعها. هنا هو وصف سير عمل شبه كمي للتصور oxi-الإشراف على التوزيع المكاني والتنميط كثافة إشارة كولوكاليزيشن.

الهدف العام لهذه التقنية هو توفير أداة حسابية لتقييم التوزيع المكاني وشدة الإشارة لتعديلات الحمض النووي ، والتي يتم تصورها عن طريق التلوين المناعي داخل النوى. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم التخلق ، مما يسمح بفحص التوطين النووي والمستويات النسبية لتعديلات الحمض النووي في أنظمة نموذجية مختلفة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن تعديلات الحمض النووي يتم قياسها بحجم إشارة الروبوت ثم توزيعها.

أحد الآثار المترتبة على هذه التقنية هو أنها تسهل فهمنا للصفوف الوظيفية المحتملة لتعديلات الحمض النووي في الأنظمة البيولوجية المختلفة. تحتوي هذه التقنية أيضا على تطبيق إضافي للتحليل الحسابي للحلقات الأخرى التي يمكن اكتشافها بواسطة الكيمياء المناعية. للبدء ، افتح الملفات المنسقة LSM لصورة المجهر متحد البؤر.

حدد معالجة الصور ثم اختر الصورة المطلوبة للتحليل. لاحظ أنه عند مقارنة ملامح الشدة بين العينات ، يجب أن تكون قوة الليزر والكسب متسقين لإجراء مقارنات مباشرة. بعد ذلك ، انقر فوق إظهار الكل ، لجعل جميع عناصر التحكم الرسومية مرئية ، ثم حدد علامة تبويب الرسومات واختر أداة المستطيل لتحديد منطقة تحتوي على النوى ذات الاهتمام.

ثم استخدم الأمر cut region لعزل منطقة الاهتمام. الآن احفظ الصورة باسم جديد وإما بتنسيق LSM أو CZI وأعد فتح الملف في برنامج Zen Blue. افتح مكتب ZEN باللون الأزرق Zen ، ثم استخدم الأمر Send to ZEN في Zen Black لفتح الملف باللون Zen Blue.

بعد ذلك ، قم بتنشيط علامة التبويب المسماة 2.5d لتمكين تصور الصورة في 2.5d. انقر فوق إظهار الكل، لجعل جميع عناصر التحكم الرسومية مرئية وتغيير الإعدادات باستخدام الأشرطة الرمادية الأربعة. تتحكم الأشرطة في التكبير, دوران, إمالة المحور وتوسيع وانكماش أشرطة المقياس.

حدد وضع العرض لتصور القمم الفردية بشكل أفضل ، ثم قم بتغيير المسافة الكبيرة عن طريق تغيير النسبة المئوية. كلما انخفضت النسبة المئوية ، زادت تحديد كل ذروة فردية. الآن قبل حفظ الصورة 2.5d ، قم بإخفاء قائمة الملفات والأدوات الرسومية بالنقر فوق السهم الرمادي أسفل مخطط 2.5d.

ثم احفظ المؤامرة كلقطة شاشة باستخدام مفتاح شاشة الطباعة على لوحة المفاتيح. افتح خيار معالجة الصور في البرنامج وافتح الملف محل الاهتمام. بعد ذلك ، حدد علامة تبويب ملف التعريف وحدد علامة التبويب إظهار الكل للوصول إلى جميع خيارات التنسيق.

من علامة تبويب ملف التعريف، اختر خيار الجدول وزر السهم. الآن استخدم الماوس لتحديد نقطة البداية ورسم خط على عدد مستمر من الخلايا ، ثم يتم إنشاء مخطط شدة للخلايا على طول هذا الخط جنبا إلى جنب مع جدول قياسات الكثافة. لاحظ أن الجدول يوفر أيضا المسافة التي تكون عندها شدة البكسل حمراء للتألق الأحمر والأخضر والأزرق.

الوحدة ميكرون. لتصدير هذه البيانات ، انقر بزر الماوس الأيمن على الجدول ، وحدد حفظ الجدول واحفظه كملف نصي. لحفظ ملف تعريف الكثافة ، اختر خيار التصدير ، في النافذة المنبثقة ، قم بتبديل خيارين ، ملف صورة مميز ، تنسيق ومحتويات نافذة الصورة ، جزء واحد ، بيانات.

ثم اتبع التعليمات لحفظ الملف. كرر الآن هذه العملية لكل ملف تعريف شدة مطلوب. في البرنامج ، حدد معالجة الصور واختر ملف الصورة الذي يثير اهتمامه.

ثم حدد علامة التبويب المسماة coloc لتحليل الترجمة المشتركة وحدد إظهار الكل للوصول إلى جميع خيارات التنسيق. من علامات التبويب الأربع في النصف السفلي من الشاشة، اختر الترجمة المشتركة واختر خيارات الجدول والصورة. ثم اختر الرمز الثالث على طول الجزء العلوي من علامة التبويب، والذي تم تحديده بواسطة النص المنبثق، المغلق.

استخدم هذه الأداة لتطويق نواة واحدة. ستظهر القيم بعد ذلك في الجدول ويتم إنتاج مخطط مبعثر للتألق الأحمر مقابل الأخضر. محور هذه المؤامرة متحرك وهذا يتحكم في بوابة الكشف.

يجب اعتبار جميع شدة البكسل داخل النواة إشارات موجبة. نظرا لأن مستويات تعديلات الحمض النووي تختلف عبر النواة ، لأخذ الإشارات الضعيفة في الاعتبار ، فإننا لا نعبر عن البيانات. يجب أن نؤكد هنا ، هذا أمر قابل للنقاش إذا كان ينبغي تضمين قيم الخلفية في التحليل.

الأهم من ذلك ، أن معامل التداخل مستقل عن الاختلافات في شدة الإشارة بين القناتين. بينما يفترض معامل ارتباط الشخص وجود علاقة خطية بين الإشارات. كرر الآن عملية تطويق النوى هذه لإكمال مجموعة البيانات.

ثم لتصدير البيانات ، انقر بزر الماوس الأيمن على الجدول واتبع الخيارات لحفظ البيانات. لحفظ صورة الترجمة المشتركة، استخدم الأمر تصدير مع الخيارين، ملف الصورة الموسوم، تنسيق ومحتويات نافذة الصورة في جزء واحد، البيانات، ثم اتبع الخيارات لحفظ الملف. تم فحص التوزيع المكاني لاثنين من المشتقات المؤكسدة لخمسة ميثيل سيتوزين في تمييز الأسلاف الهافادية ، باستخدام البروتوكول الموصوف.

تمثل الإشارات الحمراء والخضراء تعديلين متميزين للحمض النووي. الإشارات محددة جيدا مع تداخل محدود. تمشيا مع التوقعات ، فإن ملامح شدتي الإشارة والخلية المقابلة ، لا تتطابق بقوة مع بعضها البعض.

يشير النمط المميز إلى أن الأكسدة المعتمدة على الصنبور لخمسة ميثيل سيتوزين يمكن أن تولد مشتقات مؤكسدة مختلفة في مناطق كروماتين محددة. تم إجراء مقارنة مماثلة بين تعديلي الحمض النووي في خلايا الورم الأرومي النخاعي داوي وفي خلايا ورم البطاني العصبي BXD. كلتا السلالتين الخليتين من أورام الدماغ لدى الأطفال.

يكشف القياس الكمي أن خلايا BXD تظهر مستويات أقل بكثير من كلتا الإشارتين مقارنة بخلايا داوي. بعد ذلك ، تم فحص التوطين المشترك للمشتقات المؤكسدة ل 5MC في hiPSCs غير المتمايزة. في غضون 24 ساعة بعد تحريض تمايز الأديم الباطن الكبدي و hiPSCs.

في هذا التحليل ، تغير التوطين المشترك للإشارة بشكل كبير مع تحريض التمايز ، والذي ربما يعزى إلى انخفاض حجم خمسة CAC في الخلايا غير المتمايزة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء مخططات وملفات تعريف ذات كثافة 2.5d وكيفية إنتاج بيانات التعريب المشترك. تساهم أدوات تحليل الصور والتصور الموصوفة هنا في البحث اللاجيني ، مما يوفر طريقة سريعة نسبيا لمقارنة إشارات تعديلات الحمض النووي المختلفة في مجموعات تجريبية مختلفة.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في حوالي ساعة واحدة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. من المهم تجنب التعرض المفرط واستخدام نفس الإعدادات لمجموعات تجريبية مختلفة أثناء الفحص المجهري. يمكن أن تتسبب فقاعات الهواء في الحامل والغمر غير الكافي في فقدان التألق المحلي ، وبالتالي ، فإن الفحص البصري لمنطقة المسح أمر بالغ الأهمية.

يمكن أتمتة الإجراء بشكل أكبر عن طريق تقسيم النوى وإنشاء مناطق ذات أهمية باستخدام Zen Blue. يمكن استيراد هذه المناطق إلى Zen Black ، لإجراء تحليل التوطين المشترك على نوى متعددة.