منهجية الاستقراء البصاق وتجهيز المختبرات

تطوير تقنية البلغم المستحث في أوائل التسعينيات. تم اقتراح هذه التقنية للتحقيق في معلومات جديدة في مرض انسداد مجرى الهواء مثل الربو ، ومرض الانسداد الرئوي المزمن ، وفي الآونة الأخيرة كان هناك اهتمام أيضا بالنظر في معلومات جديدة في التليف الرئوي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها غير جراحية نسبيا على عكس تنظير القصبات.

تتطلب المعالجة عملا معمليا ، وتستغرق وقتا ، لذا فهي تتطلب الكثير من الوقت وتستغرق وقتا طويلا ، وتحتاج إلى بعض الخبرة في المختبر ، لذلك من الواضح أنها تقنية يصعب الحصول عليها في كل مركز. تتكون تقنية البلغم المستحث من جزأين ، الجزء الأول هو الحث ، والجزء الثاني هو المعالجة. قبل إحداث البلغم ، نحتاج إلى إجراء قياس التنفس ، وهو تقييم للحجم ومعدل التدفق الذي يستطيع المريض إنتاجه.

وعلينا القيام بذلك لأن تحريض البلغم في حد ذاته قد يسبب تشنج قصبي، لذلك نحتاج تماما إلى معرفة القيمة الأساسية لقياس التنفس للمرضى. لذلك نقوم أولا بإجراء قياس التنفس ، ثم نعطي المرضى موسعات الشعب الهوائية ، وعادة ما نعطي 400 ميكروغرام من السالبوتامول ، لفتح الشعب الهوائية للمرضى إلى أقصى حد ، وأيضا لمنع التشنج القصبي الذي قد يحدث أثناء مرحلة الحث. وبعد 15 دقيقة، نقيس مرة أخرى قياس التنفس، للحصول على ما نسميه القيمة الأساسية لقياس التنفس، وعلى وجه الخصوص ننظر إلى FEV1 وهو الحجم الذي يستطيع المريض زفيره في غضون ثانية واحدة.

صب الماء المقطر في غرفة البخاخات حتى المستوى الموصى به. ضع كوبا نظيفا في حجرة البخاخات. قم بتغطية الغطاء المملوء بالغطاء المناسب.

املأ الكوب بمحلول ملحي مفرط التوتر سعة 50 مل 5٪ إذا كان موسع ما بعد الشعب الهوائية FEV1 أكبر من 65٪ المتوقع ، أو 50 مل من محلول ملحي متساوي التوتر 9٪ إذا كان موسع الشعب الهوائية FEV1 أقل من 65٪ متوقعا. أضف 1.75 محلول كبريتات سالبوتامول بتركيز خمسة ملليغرام لكل مل إلى الكوب. قم بتوصيل الأنابيب والصمامات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

يجب إجراء هذه التقنية تحت إشراف طبي. اشرح مبدأ الاختبار للمريض. اطلب من المريض استخدام مشبك الأنف.

ابدأ تشغيل البخاخات وحدد أدنى مستوى من إعداد الهباء الجوي والمروحة. اطلب من المريض استنشاق الهباء الجوي من خلال الناطقة بلسان التنفس بالمد والجزر. يمكن زيادة مستوى إعداد الهباء الجوي والمروحة اعتمادا على تحمل المريض.

في حالة ضيق الصدر بسبب عدم الراحة التنفسية ، أوقف الإجراء وقم بإجراء قياس التنفس لقياس قيمة FEV1 للمريض. بعد خمس دقائق من الاستنشاق ، أو في حالة السعال أو الغثيان ، أوقف البخاخات. اطلب من المريض إزالة مشبك الأنف ، وشطف الفم ، والغرغرة مرتين بماء الصنبور ، والتخلص من هذا الماء في الحوض.

ثم ، كمريض يسعل البلغم ويبصق ما يخرج من الحلق في وعاء بلاستيكي. قم بإجراء أول مناورة تنفسية لقياس FEV1. بعد كل عملية مبدئية لإنتاج البلغم ، نقيس قيمة FEV1.

إذا انخفضت قيمة FEV1 بأكثر من 20٪ ، فإننا نوقف الإجراء ونعطي المرضى بخاخات بروميد الإبراتروبيوم ، وهو مضاد كولين يعمل مع ناهضات بيتا اثنين التي قمنا بإعطاؤها بالفعل أثناء العملية. إذا لم تنخفض قيمة FEV1 بأكثر من 20٪ ، فإننا نواصل الإجراء لمدة إجمالية من 10 إلى 20 دقيقة وفقا لجودة وحجم البلغم الذي ينتجه المريض. بمجرد الحصول على عينة البلغم ، احتفظ بها في الثلاجة حتى المعالجة.

إذن، يتكون الجزء الثاني من معالجة البلغم، ولهذا الغرض علينا أولا إعداد الحلين اللذين سنستخدمهما لهذه المعالجة. لذلك علينا تحضير Dithiothreitol المعروف أيضا باسم DTT. يجب تحضير المحلول عن طريق تخفيف DTT بالماء المعقم من أجل الحصول على محلول 6.5 ملليمول.

لذلك عليك تجنب تعريض DTT للهواء المحيط ، ولهذا نستخدم حقنة وإبرة. ثانيا ، يجب عليك تحضير محلول التريبان الأزرق ، ولهذا عليك إجراء تخفيف DPBS باستخدام تريبان بلو ، للحصول على محلول 0.08٪ لذلك فيما يتعلق بالبلغم ، يجب عليك نقل البلغم بالكامل في أنبوب بلاستيكي مخروطي الشكل سعة 50 مل ، ووزن العينة. أضف وزنا ثلاثة أضعاف من محلول DPBS.

بتدوير العينة ببطء لمدة 30 ثانية ، وجهاز الطرد المركزي عند 800 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. اجمع المادة الطافية في أنبوب بلاستيكي مخروطي الشكل سعة 50 مل ، بعد الترشيح من خلال طبقتين مفردتين من الشاش المعقم. قم بتخصيص المادة الطافية في أنابيب بلاستيكية سعة 2 مل وتخزينها عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر.

لاحظ أن عينات الطاف مفيدة لنا كمكون ثلاثي الطور للبلغم. إذا كان حجم منصة الخلية أقل من 5 مل ، فأضف DPBS للوصول إلى حجم 5 مل من تعليق الخلية. خفف معلق الخلية بحجم واحد من DTT عند 6.5 ملليمول.

هز تعليق الخلية لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام عامل مقعد. قم بتخفيف تعليق الخلية ثلاث مرات على الأقل باستخدام DPBS. جهاز الطرد المركزي معلق الخلية المخفف عند 550 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.

تخلص من المادة الطافية. قم بتعليق لوحة الخلايا في حوالي مل واحد DPBS. تقييم وتسجيل الحجم الدقيق لتعليق الخلية.

أضف 50 ميكرولترا من تعليق الخلية إلى 50 ميكرولتر من محلول التريبان الأزرق المخفف وتجانس. ضع العينة تحت زلة الغطاء لمقياس الخلوي الدموي ، وضعها تحت المجهر البصري. تقييم تركيز الخلية في معلق الخلية ، والنسبة المئوية للخلايا الحرشفية ، والنسبة المئوية للخلايا غير الحرشفية للبقاء.

قم بتخفيف تخصيص التعليق باستخدام DPBS للحصول على ما لا يقل عن 350 ميكرولتر من تعليق الخلية عند 500 ، 000 خلية لكل مل. قم بتجميع مكثف الخلية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل من الأجزاء الثلاث لمكثف الخلية.

تدور دقيقتين عند 150 جم في درجة حرارة الغرفة في جهاز طرد مركزي سيتو. تخلص من المادة الطافية. اترك الشريحة تجف في الهواء.

قم بتلطيخ الشريحة باستخدام div quick أو مجموعة بقع تكافؤ النيكل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. جبل مع وسيط التثبيت وغطاء الانزلاق. ضع الشريحة تحت المجهر البصري مع غمر الزيت.

عد ما لا يقل عن 500 خلية غير حرشفية ، والعدلات ، واليوزينيات ، والضامة ، والخلايا الليمفاوية ، والخلايا الظهارية ، وسجل القيم المطلقة والنسبة المئوية ونوع الخلية. فيما يتعلق بالنتائج ، باستخدام مقياس الدم ، يتعين علينا حساب الخلايا الحية غير الحرشفية غير الملونة. أيضا ، الخلايا غير الحرشفية الميتة الملونة باللون الأزرق.

والخلايا الحرشفية. هذه الخلايا هي خلايا ظهارية قادمة من الفم. إنها كبيرة ، لذلك يسهل التعرف عليها مقارنة بالخلايا البشرية الصغيرة.

لذلك عليك تجنب أيضا عد البكتيريا أو الخميرة أو الخردة. إذا كان تعليق الخلية يحتوي على أكثر من 80٪ من الخلايا الحرشفية ، فإن هذه العينة تعتبر ذات نوعية رديئة وغير مناسبة لشريحة تدور الخلوي. لذلك تعتبر هذه العينة غير ناجحة.

يتم إجراء العد على السيتوبين الملون وفقا للون الخلايا ومورفولوجيتها. العدلات ، الخصائص الرئيسية هي النواة متعددة الفصوص التي جعلت من السهل التعرف على الخلايا. هذه الخلايا مستديرة وصغيرة وملونة باللون الوردي المحايد.

تتكون هذه الخلايا من حبيبات حمراء يسهل التعرف عليها. حجم هذه الخلايا قريب من العدلات. البلاعم أكبر بمرتين إلى خمس مرات من العدلات ، وهي ملونة باللون الأزرق.

يمكن أن يحتوي السيتوبلازم على حطام وفجوات. الخلايا الليمفاوية ، هذه الخلايا مستديرة وصغيرة ، ملونة باللون الأزرق ، وتمتلك نواة كبيرة وكثيفة. الخلايا الظهارية لها شكل عمودي ، وهي ملونة باللون الوردي ، وغالبا ما تظهر أهداب في الأعلى.

فيما يلي بعض الأمثلة على عينات تساقط الخلوي غير المقروءة التي تحتوي على أكثر من 80٪ من الخلايا الحرشفية. أعتقد أنها تقنية مفيدة للغاية ، ولكن يجب أن نكون حذرين للغاية لأن تحريض البلغم يجب أن يتم تحت إشراف طبي ، لكن تقنية تحريض البلغم تمنحك الكثير من المعلومات حول الحالة الالتهابية للمرضى في الشعب الهوائية. يمكن أن يسمح لك بقياس العلامات الكيميائية الحيوية المختلفة في المادة الطافية ، ويمكنك أيضا قياس أشياء مختلفة على الأجزاء الخلوية ، لذلك يسمح لك البلغم المستحث بإجراء قياس التدفق الخلوي ، والبروتينات ، والنسخ ، وحتى علم الجينوم.