استخراج الحمض النووي القائم على المصفوفة لتسلسل الجيل التالي المستهدف على عينات البلغم الملوثة

يدور بحثنا حول تقليل الوقت المستغرق لتشخيص السل والبدء اللاحق من خلال دمج NGS لرعاية المرضى الشخصية. يعمل بروتوكولنا على تحسين TNGS للاستخدام الروتيني من خلال معالجة تكامل سير العمل والتكلفة ووقت الاستجابة ، بهدف تقليل التأخير التشخيصي وتحسين بدء العلاج في الوقت المناسب.

يسمح هذا البروتوكول باستخراج الحمض النووي الفعال من حيث التكلفة وسريع وعالي الجودة من العينات السريرية في غضون ساعات مقارنة بطرق CTAB التقليدية ، والتي تستغرق ما يصل إلى ثلاثة أيام.

تثير نتائجنا أسئلة رئيسية حول تكامل TNGS في التشخيص الروتيني وتحسين طرق الاستخراج للعينات السلبية والهزيلة لتحسين الحساسية والمنفعة السريرية. سوف نستكشف ما إذا كان يمكن استخدام عينات المخلفات من التشخيص الروتيني في التسلسل النهائي ، بما في ذلك تسلسل الجينوم الكامل المباشر للبلغم لتبسيط وتوسيع المراقبة الجينومية للسل.

[راوي] للبدء ، احصل على رواسب بلغم معطلة للحرارة. قم بالطرد المركزي للعينة عند 16,800 جم ، أو بأقصى سرعة لمدة 15 دقيقة. باستخدام ماصة من 20 إلى 200 ميكرولتر ، قم بشفط المادة الطافية برفق وتخلص منها ، مما يضمن بقاء الحبيبات دون إزعاج. رج تعليق المصفوفة برفق للخلط، ثم قم بسحب 200 ميكرولتر من المصفوفة المخلوطة جيدا لإعادة تعليق الحبيبات. انقل الحجم الكامل إلى أنبوب غطاء لولبي 1.5 مل يحتوي على ثلاث حبات زجاجية معقمة مسبقا بقطر ملليمترين. الآن ، ضع العينات في كتلة تسخين عند 56 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بتجانس العينات بدوامة لمدة 10 ثوان لتفريق الخلايا ، ثم احتضان العينات في كتلة تسخين عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قم بتجانس العينات باستخدام مجانس عالي السرعة بدورة واحدة مدتها 60 ثانية بسرعة 4.0 أمتار في الثانية. ثم قم بالطرد المركزي للتعليق عند 12,000 جم لمدة خمس دقائق. انقل 130 ميكرولتر من المادة الطافية المحتوية على الحمض النووي إلى أنبوب جديد منخفض الارتباط سعة 1.5 مل دون إزعاج الحبيبات. تخلص من الأنبوب الأول الذي يحتوي على المصفوفة وحطام الخلية. لتنقية الحمض النووي باستخدام الخرز المغناطيسي ، قم أولا بدوامة زجاجة مخزون الخرزة المغناطيسية أو أعدت الاقتباس جيدا لإعادة تعليق الخرز قبل الاستخدام ، ثم أضف 1.2 مرة من حجم الخرزات المغناطيسية إلى الحمض النووي المستخرج ، وقم بماصة المعلق 10 مرات لخلط العينات قبل الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ضع العينات على رف مغناطيسي بأنبوب 1.5 ملليلتر لمدة ثلاث دقائق ، أو حتى يصبح السائل صافيا ، ثم قم بشفط المادة الطافية بعناية وتخلص منها دون إزعاج الخرز. مع وجود الأنابيب الموجودة على المغناطيس ، أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 80٪ ، مما يضمن بقاء الخرزات دون إزعاج. بعد حضانة لمدة 30 ثانية ، قم بشفط الإيثانول بعناية والتخلص منه دون إزعاج الخرز. بعد الغسيل الثاني ، قم بإزالة أي إيثانول متبقي باستخدام ماصة من واحد إلى 10 ميكرولتر. اترك الأنابيب مفتوحة لتجفيف الخرز في الهواء لمدة 10 دقائق ، أو حتى يصبح لها مظهر غير لامع. بمجرد أن يصبح للحبات مظهر غير لامع ، قم بإزالة الأنابيب من المغناطيس وأضف 50 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز مباشرة على الخرز في كل عينة. ثم امزج كل عينة على حدة عن طريق سحب العينة 10 مرات. افحص الأنبوب بحثا عن أي حبات عالقة بالداخل. بعد حضانة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ضع الأنابيب مرة أخرى على الرف المغناطيسي لمدة ثلاث دقائق ، أو حتى يصبح السائل صافيا. باستخدام الأنابيب الموجودة على الرف المغناطيسي ، انقل المادة الطافية المحتوية على الحمض النووي إلى أنبوب معقم منخفض الارتباط ملحوظ بوضوح. كان تركيز الحمض النووي أعلى في عينات الرواسب سعة ملليلترين ، مقارنة ب 500 ميكرولتر عبر جميع درجات اللطاخة. لوحظ تباين أكبر في إنتاجية الحمض النووي في عينات الرواسب 500 ميكرولتر. كان عمق تغطية قراءات التسلسل أعلى في عينات الرواسب سعة ملليلترين مقارنة ب 500 ميكرولتر عبر جميع درجات اللطاخة. كان التباين أكبر في ثلاث عينات زائد من درجة اللطاخة المستخرجة من رواسب 500 ميكرولتر. كانت درجات قبول التسلسل أعلى بشكل عام في عينات ملليلتر مقارنة ب 500 ميكرولتر ، مع نسبة أكبر من النتائج المقبولة للغاية. حصلت عينات اللطاخة من الدرجة الثالثة زائد على أعلى نسبة من النتائج المقبولة ، مقارنة بدرجات اللطاخة الأولى الزائدة والثانية زائد. تحتوي العينات التي تبلغ سعتها 500 ميكرولتر على المزيد من الحالات المصنفة على أنها غير مقبولة أو غير محددة.