Simultaneous Distinction of Monospecific and Mixed DFS70 Patterns During ANA Screening with a Novel HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout Substrate

Kishore S. Malyavantham; Lakshmanan Suresh

doi:10.3791/56722

تمييز واحد من مونوسبيسيفيك وأنماط DFS70 مختلطة أثناء الفحص أنا مع الركازة رواية خروج المغلوب النخ...

JoVE Journal
Immunology and Infection

This content is Free Access.

JoVE Journal Immunology and Infection

Simultaneous Distinction of Monospecific and Mixed DFS70 Patterns During ANA Screening with a Novel HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout Substrate

تمييز واحد من مونوسبيسيفيك وأنماط DFS70 مختلطة أثناء الفحص أنا مع الركازة رواية خروج المغلوب النخبة/DFS70 أبو عبدالله 2

Full Text

37,492 Views

10:05 min

January 17, 2018

DOI: 10.3791/56722-v

Kishore S. Malyavantham¹, Lakshmanan Suresh¹

¹Research & Development, Immco Diagnostics,A Trinity Biotech Company

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This article presents a novel indirect immunofluorescent assay using a dense fine speckled 70 knockout HEp-2 substrate for screening antinuclear autoantibodies (ANAs). The improved method enhances the ability to distinguish DFS70 patterns from other disease-associated ANA patterns, providing high confidence in results.

Key Study Components

Area of Science

Immunology
Autoimmunity
Diagnostic Techniques

Background

DFS70 autoantibodies can mimic common ANA patterns.
Conventional HEp-2 substrates may lead to misinterpretation.
Novel substrates improve diagnostic accuracy.
Understanding ANA patterns is crucial for autoimmune disease diagnosis.

Purpose of Study

To demonstrate a new assay for ANA screening.
To improve the distinction of DFS70 patterns.
To enhance confidence in diagnosing monospecific and mixed ANA cases.

Methods Used

Indirect immunofluorescence using engineered HEp-2 substrates.
Incubation of patient sera with substrate slides.
Fluorescent microscopy for pattern interpretation.
Comparison of results between conventional and novel substrates.

Main Results

The novel substrate allows clear distinction of DFS70 patterns.
Improved accuracy in identifying mixed ANA patterns.
Positive and negative controls validate the assay.
Results demonstrate significant differences in fluorescence intensity.

Conclusions

The new assay enhances the reliability of ANA screening.
It provides a robust method for distinguishing complex ANA patterns.
This advancement may lead to better diagnostic outcomes for autoimmune diseases.

Frequently Asked Questions

What are DFS70 autoantibodies?

DFS70 autoantibodies are a type of antinuclear antibody that can mimic patterns associated with various autoimmune diseases, complicating diagnosis.

How does the novel HEp-2 substrate improve ANA screening?

The novel HEp-2 substrate allows for better differentiation of DFS70 patterns from other disease-associated patterns, enhancing diagnostic accuracy.

What is the significance of using indirect immunofluorescence?

Indirect immunofluorescence is a sensitive technique that allows for the visualization of specific antibodies bound to antigens in cells, crucial for accurate diagnosis.

What role do controls play in the assay?

Controls are essential for validating the assay's performance, ensuring that results are reliable and interpretable.

Can this method be used for all types of autoimmune diseases?

While this method is focused on ANA screening, it may not cover all autoimmune diseases, as different conditions may require specific tests.

What are the implications of improved ANA screening?

Improved ANA screening can lead to more accurate diagnoses, better patient management, and potentially improved outcomes for individuals with autoimmune diseases.

الأجسام المضادة DFS70 تحاكي الأنماط الشائعة المرتبطة بالمرض جسم النواة مما يجعل صعبة التفسير الدقيق عند استخدام ركائز HEp-2 التقليدية. ويصف البروتوكول مزايا الرواية الركيزة HEp-2 تصميم أكثر من 2 HEp التقليدية في أنا الفرز والتمييز بين الأنماط DFS70 بثقة عالية في كل من مونوسبيسيفيك وأنا مختلطة الحالات الإيجابية.

الهدف العام من هذا الإجراء هو إظهار اختبار فلوري مناعي محسن وغير مباشر يستخدم Novel HEp-2 ، ركيزة 70 ضربة قاضية كثيفة دقيقة لفحص الأجسام المضادة للنواة وتأكيد 70 نمطا أحادي النوع ومختلط من البقع الدقيقة. تستخدم ركيزة HEp-2 الجديدة إجراء تألق مناعي قياسي وغير مباشر ومعايير تفسير لفحص الأجسام المضادة للنواة ذات الصلة سريريا ، والتي تعرف أيضا باسم ANAs. الميزة الرئيسية هي القدرة على التمييز بين نمط 70 المرقط الناعم الكثيف والأنماط المختلطة المرتبطة بالأمراض أو المتجانسة أو المختلطة الصعبة في خطوة الفحص.

ستظهر الإجراء صوفيا بادانين ، فنية من مختبر مراقبة الجودة لدينا. بالنسبة لشرائح الركيزة ، استخدم شرائح زجاجية بها 12 بئرا في كل شريحة ، تحتوي إما على خلايا HEp-2 التقليدية ، أو خليط من 70 خلية HEp-2 التقليدية والكثيفة المرقطة بالضربة القاضية. اسمح للأكياس التي تحتوي على شرائح الركيزة بالتوازن مع درجة حرارة الغرفة للحصول على الأداء الأمثل ولمنع تكثيف الرطوبة على سطح الشريحة قبل إضافة العينة.

يجب أن يستغرق هذا ما بين 10 و 15 دقيقة. بمجرد موازنة درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة شرائح الركيزة بعناية باستخدام أصابع المرء ، وتجنب ملامسة الشرائح وجوانب الحقيبة. قم بتسمية الشرائح وضعها في غرفة حضانة مبطنة بمناشف ورقية مبللة لمنع جفاف الشرائح أثناء أخذ العينة والحضانة المترافقة.

قم بتوزيع ما يقرب من 50 ميكرولترا من عناصر التحكم السلبية والإيجابية ، بالإضافة إلى مصل المريض المخفف على آبار الشرائح الفردية قبل وضع الشرائح في غرفة الحضانة. اختبار ANA هو الخطوة الأولى في فحص أمراض المناعة الذاتية. من الأهمية بمكان تجنب التلوث المتبادل لعينات المرضى على الشريحة لتقليل النتائج الإيجابية أو السلبية الخاطئة.

لمنع التلوث المتبادل جيدا ، تجنب الإفراط في ملء الآبار. ضع الغطاء على حجرة الحضانة واحتضن الشرائح لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إذا كان هناك أي ANA موجود في مصل المريض ، فسوف يرتبط بالخلايا الموجودة في كل إرادة خلال هذا الوقت.

بمجرد انتهاء فترة الحضانة ، قم بإزالة الشريحة من غرفة الحضانة. أمسك الشريحة في نهاية اللسان واشطفها برفق لمدة 10 إلى 15 ثانية باستخدام ما يقرب من 10 ملليلتر من محلول الغسيل الملحي المعاد تكوينه من الفوسفات المخزن مؤقتا. انقل الشريحة على الفور إلى برطمان كوبلين مع مخزن غسيل PBS وانقعها لمدة 10 دقائق.

كرر العملية مع جميع الشرائح المتبقية. قم بإزالة شريحة واحدة فقط في كل مرة من جرة كوبلين. لإزالة المخزن المؤقت الزائد لغسيل PBS من الشريحة ، اضغط برفق على الشريحة أو امسح الشريحة على منشفة ورقية.

على كل بئر ، ضع برفق قطرة واحدة من إيزوثيوسيانات الفلوريسئين ، المسمى مترافق الفلورسنت IgG المضاد للإنسان. ثم احتضن الشرائح في غرفة حضانة التلوين المغلقة لمدة 30 دقيقة. بمجرد انتهاء فترة الحضانة ، قم بإزالة الشريحة من غرفة الحضانة.

أمسك الشريحة في نهاية اللسان واشطفها برفق كما كان من قبل ، مع ما يقرب من 10 ملليلتر من مخزن غسيل PBS. انقل الشريحة على الفور إلى برطمان كوبلين مع مخزن غسيل PBS وانقعها لمدة 10 دقائق. ضع زلات الغطاء المتوفرة في المجموعة على منشفة ورقية جافة.

على الحافة السفلية لزلة الغطاء، ضع ما بين 3 و4 قطرات من وسائط التثبيت في خط. بعد ذلك ، أخرج شريحة واحدة في كل مرة من جرة Coplin التي تحتوي على مخزن الغسيل. لإزالة المخزن المؤقت للغسيل الزائد ، اضغط برفق على الشريحة الموجودة على المنشفة الورقية أو امسح لها.

تجنب ترك كمية زائدة من عازلة الغسيل على الشريحة ، أو الضغط الشديد على زلة الغطاء أو إدخال فقاعات الهواء. كل هذا يمكن أن يؤثر على مورفولوجيا الخلية وأنماط الفلورسنت الناتجة وشدة التفاعلات. اخفض الشريحة برفق على زلة الغطاء، عن طريق وضع الحافة السفلية للشريحة على حافة زلة الغطاء.

يسمح ذلك لوسائط التثبيت الموجودة على زلة الغطاء بالتدفق إلى الحافة العلوية للشريحة ويقلل من تكوين فقاعات الهواء ، والتي قد تتداخل مع قراءة كل بئر. اعرض الشرائح باستخدام مجهر الفلورسنت ، باستخدام مجموعة مرشح إيزوثيوسيانات الفلوريسين الموجودة في غرفة مظلمة. افحص العينة بحثا عن مضان أخضر ساطع محدد تحت المجهر بتكبير 200 ضعف أو أكثر لإجراء التفسير النهائي فيما يتعلق بالإيجابية والنمط.

راقب الضوابط الإيجابية والسلبية. سيعرض التحكم الإيجابي تألق أخضر ساطع في النواة. لن يعرض عنصر التحكم السلبي أي مضان أخضر محدد تحت المجهر الفلوري.

سجل النتيجة الإيجابية أو السلبية لكل بئر وقم بتضمين نمط ANA للحالات الإيجابية. HEp-2 كثيفة دقيقة مرقطة 70 ركيزة بالضربة القاضية تحافظ على جميع الأنماط النووية والسيتوبلازمية الرئيسية. يتميز النمط المرقط الناعم الكثيف بوجود تلطيخ مرقط موزع بشكل موحد في جميع أنحاء نواة الطور البيني والكروماتين في المرحلة الانقسامية.

إن وجود كل من خلايا HEp-2 التقليدية التي تعبر عن مستضد 70 مرقط ناعم كثيف وخلايا HEp-2 المصممة هندسيا الخالية من المستضد يسهل التمييز الدقيق لنمط 70 المرقط الناعم الكثيف ، مع الاحتفاظ بجميع مزايا ركائز HEp-2 التقليدية. تم خلط الأمصال الإيجابية لأنماط ANA الرئيسية المرتبطة بالأمراض مع مصل كثيف ناعم مرقط 70 نمطا إيجابيا بنسب متساوية وتم اختباره على كل من HEp-2 التقليدي و HEp-2 70 ركيزة خروج المغلوف. هنا ، تشير الأسهم الحمراء إلى الخلايا في المرحلة الانقسامية.

تشير الأسهم الصفراء إلى نوى HEp-2 التقليدية وتشير الأسهم الزرقاء إلى نوى HEp-2 المهندسة هندسيا. بالنسبة لجميع مجموعات التفاعلات المصورة ، تظهر الركيزة الكثيفة الدقيقة المرقطة 70 فرقا واضحا في الشدة بين الخلايا غير المعدلة والخلايا الهندسية في نفس مجال الرؤية. يساعد هذا في التمييز بين 70 تفاعلا أحادي محدد ومختلط كثيف مرقط.

تنتشر الأجسام المضادة الذاتية للمستضدات النووية والسيتوبلازمية بشكل كبير في أمراض المناعة الذاتية الجهازية. تم الإبلاغ عن أن النمط المرقط الدقيق الكثيف الناتج عن الأجسام المضادة الذاتية تجاه DFS70 ، المعروف أيضا باسم بروتين PSIP1 ، منتشر بشكل كبير بين السكان الأصحاء. علاوة على ذلك ، تحدث هذه الأجسام المضادة الذاتية DFS70 بمعزل عن بعضها البعض وكذلك مع ANAs الأخرى المرتبطة بالأمراض.

هذا يجعل من الأهمية بمكان للمختبرات السريرية التمييز بدقة بين هذا النمط والأنماط الأخرى المرتبطة بالأمراض. على سبيل المثال ، في النمط المرقط المتجانس المختلط ، المرتبط بالذئبة ، يمكن إساءة تفسيره على أنه نمط DFS70 الذي يستلزم فحوصات تأكيدية متعددة. تعتبر طريقة التألق المناعي غير المباشر باستخدام ركائز HEp-2 طريقة الفحص القياسية الذهبية ل ANAs.

ومع ذلك ، فإن الدقة تعتمد بشكل كبير على مهارة الفني والتنفيذ الدقيق للخطوات الفردية والتفسير الدقيق للأنماط الناتجة. على العكس من ذلك ، يوضح التقييم المقارن لركائز الضربة القاضية التقليدية HEp-2 و DFS70 فائدة هذه الركيزة الجديدة في تمييز نمط DFS70 بثقة عالية ، أثناء فحص ANAs. تم تبسيط التفسير الإضافي لكل من أنماط DFS70 أحادية الإيجابية والمختلطة نسبيا باستخدام ركيزة HEp-2 المحسنة.

تستخدم الركيزة الجديدة بروتوكول تألق مناعي قياسي غير مباشر ومعايير تفسير محددة لجميع أنماط ANA ذات الصلة سريريا.