وPCR الفحص دوبلكس الرقمي للوقت واحد الكمي ل المعوية النيابة. وما يرتبط بها من البراز-الإنسان HF183 علامة في المياه

الهدف العام من اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي المزدوج هو تحديد التلوث العام والمرتبط بالبراز البشري في المياه في وقت واحد. يمكن أن يساعد هذا الفحص في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في تحسين جودة المياه الترفيهية مثل مقدار مؤشر البراز العام ، أي المكورات المعوية والأهم من ذلك وجود علامة HF183 المرتبطة بالبراز البشري في المياه.

الميزة الرئيسية لهذا الاختبار هي أنه يحدد هدفين في تفاعل واحد ومقارنته ب qPCR ، فإنه يلغي الحاجة إلى تشغيل المنحنيات القياسية وبالتالي التحيز المرتبط والتباين. ستظهر الإجراء ميريديث رايث ، كبيرة فني الأبحاث لدينا. لبدء هذا الإجراء ، قم أولا بإعداد 100 ميكرومول لكل لتر تركيزات مخزون لجميع البادئات في المياه الجزيئية والمجسات في TEPH 8 Buffer كما هو موضح في نص البروتوكول.

بعد ذلك ، قم بإعداد Master Mix عن طريق خلط كميات مناسبة من مزيج PCR الرقمي ، والبادئات الأمامية والعكسية ، ومسبار الفلورسنت ، والماء الخالي من النوكلياز. الماصة لأعلى ولأسفل 10 مرات على الأقل للخلط مع توخي الحذر من إدخال فقاعات الهواء في المحلول. نظرا لأن dPCR Master Mix أكثر لزوجة من qPCR Master Mix التقليدي ، فمن الضروري استخدام الخلط عن طريق تقنية سحب العينات من أجل إنشاء محلول متجانس.

هذا يسمح بقياس dPCR بدقة في اتجاه المصب. لعمل خليط الفحص لتوليد القطرات لتشغيل العينات في نسختين، قم بتعبئة 36 ميكرولترا من Master Mix في لوحة PCR عادية. لكل من الخلطات الرئيسية سعة 36 ميكرولتر ، امزج 12 ميكرولترا من قالب الحمض النووي مع ترك الآبار المتكررة المقابلة فارغة على اللوحة.

قم بتضمين عناصر تحكم إيجابية لضمان تشغيل الفحص بشكل صحيح. قم بتضمين No Template Controls أو NTCs لضمان عدم وجود تلوث داخل اللوحة ولتعيين خط الأساس الفلوري لاحقا لتحليل البيانات. قبل إعداد مولد القطرات، امزج مخاليط الفحص باستخدام ماصة متعددة القنوات لسحب المخاليط لأعلى ولأسفل 15 مرة تقريبا.

تأكد من بقاء طرف الماصة داخل السائل لتجنب ظهور فقاعات وصول داخل الخليط. بعد ذلك ، أدخل الخرطوشة التي تحتوي على ثمانية آبار في حامل خرطوشة أبيض وانقر فوق حامل الخرطوشة للإغلاق. الخرطوشة الأولى الآن ثابتة في مكانها ولا يمكن إزاحتها من الحامل أثناء توليد قطرات.

باستخدام ماصة متعددة القنوات، انقل 20 ميكرولترا من خليط الفحص برفق إلى الموضع الأوسط للعينة المميزة بالخرطوشة دون إدخال فقاعات هواء. الماصة في 70 ميكرولتر من زيت Droplet Generation على الجانب الأيسر من الزيت المميز بالخرطوشة. قم بتغطية الخرطوشة بحشية مع التأكد من أن الحشية مسطحة ومثبتة بالتساوي بواسطة القراد الأربعة باتجاه حافة الخرطوشة.

اضغط على الزر المضاء باللون الأخضر في Droplet Generator لفتح الباب ووضع الخرطوشة. اضغط على الزر مرة أخرى لإغلاق المولد. بمجرد إغلاق الباب ، يتم تعتيم الزر الأخضر ولا يمكن إعادة فتح الباب.

سيبدأ توليد القطرات على الفور ويستمر لمدة دقيقة واحدة تقريبا. أثناء تقدم Droplet Generation ، ضع الخرطوشة الثانية في حامل خرطوشة بيضاء ثان وقم بإعدادها بنفس طريقة الخرطوشة الأولى. عند اكتمال Droplet Generation ، سيتحول الزر ذي الإضاءة الخافتة إلى اللون الأخضر.

افتح باب مولد القطرات ، وقم بإزالة حامل الخرطوشة الأبيض الذي يحتوي على الخرطوشة وضعه جانبا. ضع الخرطوشة الثانية في مولد القطرات. قم بإزالة الحشية من الخرطوشة وتخلص منها.

لا تقم بإلغاء النقر فوق حامل الخرطوشة الأبيض لأن الإجراء قد يكسر القطرات التي تم إنشاؤها حديثا. باستخدام ماصة متعددة القنوات مضبوطة على 40 ميكرولترا، أدخل الأطراف في العمود الثالث من القطرات المميزة بالخرطوشة بزاوية 45 درجة وقم بسحب جميع القطرات ببطء. انقلها إلى لوحة PCR النهائية عن طريق وضع طرف الماصة على جدار البئر في منتصف الطريق تقريبا وطرد القطرات ببطء.

بنفس الطريقة ، عند اكتمال توليد القطرات للخرطوشة الثانية ، قم بإزالة الحشية من الخرطوشة الثانية وانقل القطرات المتولدة إلى لوحة PCR النهائية. ضع غطاء رقائق معدنية قابل للثقب أعلى الطبق وضعه على مادة مانعة للتسرب من اللوحة. اضبط مانع التسرب على 180 درجة مئوية ، واضغط على تشغيل على مانع التسرب ، وأغلقه لمدة 10 ثوان.

لبدء هذا الإجراء ، ضع لوحة PCR النهائية محكمة الغلق في الدراجة الحرارية. استخدم جهاز تدوير حراري متوافق مع لوحة PCR النهائية وبسرعة تكثيف درجة الحرارة تبلغ درجتين سلسيتين في الثانية. قم بتشغيل البرنامج الحراري التالي لمدة عشر دقائق عند 95 درجة مئوية متبوعا ب 40 دورة مدة كل منهما 30 ثانية عند 94 درجة مئوية و 60 ثانية عند 60 درجة مئوية متبوعة بعشر دقائق عند 98 درجة مئوية.

عند الانتهاء من ركوب الدراجات ، انقل اللوحة إلى قارئ القطرات للقياس التلقائي للفلورسنت في كل قطرة في كل بئر. تأكد من أن القطرات في درجة حرارة الغرفة قبل متابعة قراءة القطرات. ابدأ بفتح البرنامج المصاحب لإعداد قراءة القطرات.

في قائمة الإعداد الافتراضية التي تحتوي على مخطط للوحة بئر 96 فارغة ، انقر نقرا مزدوجا فوق البئر A1 لفتح القائمة التي تحتوي على ثلاثة أقسام ، العينة ، المقايسة 1 والمقايسة 2. في قسم العينة، اكتب معرف العينة في المربع المسمى الاسم وحدد المربع الموجود على اليمين وضع علامة تطبيق. بعد ذلك ، انقر فوق القائمة المنسدلة المسماة تجربة ، واختر RED ل Rare Event Detection وانقر فوق Enter.

انتقل إلى القسم الذي يدل على الاختبار 1. في قسم الاسم، املأ المقايسة وانقر فوق إدخال. في المربع أدناه المسمى النوع، انقر على القائمة المنسدلة، واختر القناة 1 غير معروفة وانقر على إدخال.

انتقل إلى القسم الذي يدل على الفحص 2. في قسم الاسم، املأ المقايسة وانقر فوق إدخال. في المربع أدناه المسمى النوع، انقر فوق القائمة المنسدلة، واختر القناة 2 غير معروفة وانقر على Enter.

جميع المعلومات من الخطوات السابقة موجودة الآن في بئر A1.Name جميع الآبار اللاحقة التي تحتوي على قطرات. لتوفير إجمالي وقت الإعداد ، انقر فوق shift أو التحكم لاختيار آبار متعددة في وقت واحد. عندما يعكس التصوير الرقمي للوحة اللوحة المادية، اضغط على موافق في أسفل يمين القائمة.

في القائمة الجديدة التي تظهر في الجزء العلوي من مخطط اللوحة، ضمن القالب اختر حفظ باسم وقم بتسمية اللوحة واحفظها. على يسار الشاشة ، انقر فوق Run وحدد Dye Set المناسب في نافذة Run Options المنبثقة. سيبدأ جمع البيانات ويتم عرضه في الوقت الفعلي في البرنامج.

عند انتهاء القارئ وظهور مربع يوضح "تشغيل الاكتمال"، انقر فوق موافق. تحقق من الفصل بين القطرات الموجبة والسالبة. تأكد من أن الفلورسنت في جميع القطرات في آبار NTC قريبة من خط الأساس. انقر فوق الزر المسمى الأحداث.

في الجزء السفلي ، انقر فوق المربع المسمى مفرد وعلى يمين الرسم البياني المعروض ، انقر فوق المربع المسمى Total لتقسيم العدد الإجمالي للقطرات المقبولة لكل بئر. استبعاد أي آبار تحتوي على أقل من 10،000 قطرة عن طريق الضغط على مفتاح التحكم والنقر على الآبار المراد استبعادها. انقر فوق الزر المشار إليه بالسعة 1D لضبط عتبة الفلورسنت عند انحراف معياري واحد تقريبا للقطرات السالبة في آبار NTC لكلا الهدفين.

في أقصى يسار الشاشة أسفل التحليل التلقائي الذي يعرض زرين للعتبة ، اختر الرمز الموجود على اليمين الذي يحتوي على خط أفقي وردي ثابت يمر عبره. انقر فوق المربع الموجود على يسار تعيين العتبة أسفل كل من الرسوم البيانية للسعة وأدخل قيم عتبة التألق المناسبة. ثم يتم حساب التركيزات المستهدفة في النسخة لكل تفاعل ميكرولتر تلقائيا.

قم بتصدير النتائج في ملف CSV بالنقر فوق تصدير زر في الزاوية العلوية اليسرى على شاشة 1D Amplitude. في ملف CSV ، اضرب تركيز الهدف المصدر بأربعة لتحويله من نسخة من الهدف لكل تفاعل ميكرولتر ، إلى نسخة من الهدف لكل قالب ميكرولتر من الحمض النووي. يقارن هذا الشكل بين التنسيقات المزدوجة والبسيطة لمقايسة تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي.

اللوحا الأيسر والأيمن المكورات المعوية والقياس الكمي HF183 على التوالي مع معاملات الارتباط المقابلة بين نتائج الازدواج والفردي. تشير الخطوط الصلبة إلى خطوط الانحدار ويشير التظليل الرمادي إلى الأخطاء القياسية المقابلة. يشار إلى أنواع مختلفة من العينات بالرموز.

النتائج متسقة للغاية ولا يمكن تمييزها في كثير من الأحيان ما إذا كان يتم قياس المكورات المعوية و HF183 في وقت واحد في تفاعل واحد أو بشكل منفصل في تفاعلين. يمكن لمقايسة تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمية أيضا أن تتحمل المثبطات بتركيزات أعلى من مرتبة إلى مرتبتين من تلك التي تتحملها نظيراتها في qPCR. يوضح هذا الشكل qPCR والقياس الكمي الرقمي ل PCR لعلامة HF183 في الحمض النووي لمياه الصرف الصحي النظيفة مع زيادة تكثيف حمض الهيوميك الذي يثبط تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

يتم تعريف القياس الكمي المتوقع ل HF183 في حالة عدم وجود مثبطات على أنه تداخل ثقة بنسبة 95٪ بين الخطين المنقطين الأفقيين. يستمر تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي المشار إليه بالمثلثات في توفير تقدير دقيق يصل إلى تركيز حمض الهيوميك البالغ 15 نانوغرام لكل تفاعل ميكرولتر بينما يبدأ qPCR المشار إليه بالصلبان في التقليل من شأن نانوغرام واحد لكل ميكرولتر ويصبح مثبطا تماما عند خمسة نانوجرام لكل ميكرولتر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء اختبار PCR الرقمي HF183 Duplex Droplet المعوي أو أي فحص آخر مماثل باستخدام بادئات ومجسات مختلفة.

منذ تطوير هذا الاختبار المزدوج الذي تم نشره في أبحاث المياه في عام 2015 ، قمنا بتطوير والتحقق من صحة عدد كبير من فحوصات تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمية الأخرى التي تستهدف بكتيريا مؤشر البراز العام ، وعلامات التتبع الميكروبية ، ومسببات الأمراض المنقولة بالماء. توفر هذه المقايسات تقديرا كميا مباشرا وغير متحيز لهدفها وأصبحت بدائل مفيدة لمقايسات qPCR في مجال اختبار جودة المياه.