وPCR الفحص دوبلكس الرقمي للوقت واحد الكمي ل

الهدف العام من اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي المزدوج (Duplex Digital PCR Assay) هذا هو التقدير الكمي المتزامن للتلوث البرازي العام والمرتبط بالبشر في المياه. يمكن لهذا الاختبار المساعدة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مراقبة جودة المياه الترفيهية، مثل تحديد كمية المؤشر البرازي العام، أي Enterococcus، والأهم من ذلك، كمية الواسم HF183 المرتبط بالبراز البشري في المياه.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذا المقايسة في أنها تحدد كمية هدفين في تفاعل واحد، وبالمقارنة مع qPCR، فإنها تلغي الحاجة إلى تشغيل منحنيات قياسية، وبالتالي تلغي الانحياز والتباين المرتبطين بذلك. ستقوم ميريديث رايث، فنية الأبحاث الأقدم لدينا، بتوضيح الإجراء. لبدء هذا الإجراء، قم أولاً بتحضير تركيزات مخزنة بمقدار 100 Micromole per liter لجميع البادئات في Molecular Grade Water والمجسات في TEPH 8 Buffer كما هو موضح في نص البروتوكول.

بعد ذلك، قم بتحضير المزيج الرئيسي (Master Mix) عن طريق خلط كميات مناسبة من مزيج الـ Digital PCR، والبادئات الأمامية والعكسية، والمسبار الفلوري، والماء الخالي من النيوكلياز (Nuclease-Free Water). قم بالسحب والدفع بالماصة (Pipetting) 10 مرات على الأقل للمزج مع توخي الحذر لتجنب إدخال فقاعات هواء في المحلول. ونظرًا لأن المزيج الرئيسي لـ dPCR أكثر لزوجة من المزيج الرئيسي التقليدي لـ qPCR، فمن الضروري استخدام تقنية المزج بواسطة الماصة من أجل الحصول على محلول متجانس.

يسمح ذلك بإجراء تقدير كمي دقيق بواسطة dPCR في الخطوات اللاحقة. ولتحضير مزيج المقايسة لتوليد القطيرات لتشغيل العينات في مكررات ثنائية، يتم نقل 36 µL من المزيج الرئيسي (Master Mix) باستخدام الماصة إلى طبق PCR عادي. ثم تضاف 12 µL من قالب DNA إلى كل كمية من المزيج الرئيسي (36 µL)، مع ترك آبار المكررات المقابلة فارغة في الطبق.

يجب إدراج ضوابط موجبة لضمان عمل المقايسة بشكل صحيح. كما يجب إدراج ضوابط خالية من القالب (No Template Controls - NTCs) للتأكد من عدم وجود تلوث داخل اللوح، ولتحديد الخط المرجعي للفلورة لاحقاً عند تحليل البيانات. قبل إعداد مولد القطيرات، قم بمزج مخاليط المقايسة باستخدام ماصة متعددة القنوات عن طريق سحب ودفع المخاليط للأعلى والأسفل حوالي 15 مرة.

تأكد من بقاء طرف الماصة مغموراً داخل السائل لتجنب تكوّن فقاعات هوائية داخل الخليط. بعد ذلك، أدخل الخرطوشة الأولى التي تحتوي على ثماني آبار في حامل خرطوشة أبيض وأغلق الحامل بإحكام. أصبحت الخرطوشة الأولى الآن مثبتة بإحكام ولا يمكن تحركها من الحامل أثناء توليد القطيرات.

باستخدام ماصة متعددة القنوات، انقل بلطف 20 µL من خليط المقايسة إلى الموضع الأوسط من الخرطوشة المحدد بكلمة sample مع تجنب إدخال فقاعات هوائية. ثم انقل 70 µL من زيت توليد القطيرات إلى الجانب الأيسر من الخرطوشة المحدد بكلمة oil. غطِّ الخرطوشة بحشوة مانعة للتسرب، مع التأكد من أن الحشوة مسطحة ومثبتة بشكل متساوٍ بواسطة العلامات الأربع الموجودة باتجاه حافة الخرطوشة.

اضغط على الزر المضاء باللون الأخضر في مولد القطيرات (Droplet Generator) لفتح الباب ووضع الخرطوشة. اضغط على الزر مرة أخرى لإغلاق المولد. بمجرد إغلاق الباب، ينطفئ ضوء الزر الأخضر ولا يمكن إعادة فتح الباب.

ستبدأ عملية توليد القطيرات فوراً وتستمر لمدة دقيقة واحدة تقريباً. وأثناء استمرار توليد القطيرات، ضع الخرطوشة الثانية في حامل خرطوشة أبيض ثانٍ وقم بتجهيزها بنفس الطريقة التي اتبعتها مع الخرطوشة الأولى. وعند اكتمال عملية توليد القطيرات، سيتحول الزر الخافت الإضاءة إلى اللون الأخضر.

افتح باب مولد القطيرات، وأخرج حامل الخرطوشة الأبيض الذي يحتوي على الخرطوشة الأولى وضعه جانباً. ضع الخرطوشة الثانية في مولد القطيرات. قم بإزالة الحشية من الخرطوشة الأولى وتخلص منها.

تجنب تحرير حامل الخراطيش الأبيض لأن هذا الإجراء قد يؤدي إلى تكسير القطيرات المتولدة حديثاً. وباستخدام ماصة متعددة القنوات مضبوطة على 40 µL، أدخل الرؤوس في العمود الثالث من الخرطوشة المسمى droplets بزاوية 45 درجة وقم بسحب جميع القطيرات ببطء. انقلهما إلى لوحة PCR النهائية عن طريق وضع رأس الماصة مقابل جدار البئر عند منتصف العمق تقريباً وطرد القطيرات ببطء.

وبالمثل، عند اكتمال عملية توليد القطيرات للخرطوشة الثانية، قم بإزالة الحشية من الخرطوشة الثانية وانقل القطيرات المتولدة إلى لوحة PCR النهائية. ضع غطاءً من رقائق الألومنيوم القابلة للثقب فوق اللوحة وثبتها في جهاز ختم الألواح. اضبط جهاز الختم على 180 degrees celsius، ثم اضغط على زر التشغيل في الجهاز، وقم بالختم لمدة 10 ثوانٍ.

لبدء هذا الإجراء، ضع لوحة PCR النهائية المغلقة في جهاز التدوير الحراري. استخدم جهاز تدوير حراري متوافق مع لوحة PCR النهائية وبسرعة تدرج حراري تبلغ 2 °C في الثانية. قم بتشغيل البرنامج الحراري التالي: 10 دقائق عند 95 °C، تليها 40 دورة تتكون من 30 ثانية عند 94 °C و60 ثانية عند 60 °C، ثم فترة تثبيت لمدة 10 دقائق عند 98 °C.

عند الانتهاء من الدورات، انقل اللوحة إلى قارئ القطرات (Droplet Reader) للقياس التلقائي للفلورة في كل قطرة داخل كل بئر. تأكد من أن القطرات في درجة حرارة الغرفة قبل البدء في عملية قراءة القطرات. ابدأ بفتح البرنامج المرفق لإعداد عملية قراءة القطرات.

في قائمة الإعداد الافتراضية التي تحتوي على مخطط لطبق 96 بئر فارغ، انقر نقراً مزدوجاً على البئر A1 لفتح القائمة التي تحتوي على ثلاثة أقسام: العينة (Sample)، والمقايسة 1 (Assay 1)، والمقايسة 2 (Assay 2). في قسم العينة (Sample)، اكتب معرف العينة (Sample ID) في المربع المسمى "الاسم" (Name)، ثم حدد المربع الموجود على اليمين والمسمى "تطبيق" (Apply). بعد ذلك، انقر على القائمة المنسدلة المسمى "تجربة" (experiment)، واختر RED للكشف عن الأحداث النادرة (Rare Event Detection)، ثم انقر على "إدخال" (Enter).

انتقل إلى القسم المحدد بـ Assay 1. وفي قسم Name، قم بتعبئة Assay ثم اضغط على Enter. وفي المربع الموجود أدناه والمسمى Type، انقر على القائمة المنسدلة، واختر Channel 1 Unknown ثم اضغط على Enter.

انتقل إلى القسم المسمى Assay 2. في قسم الاسم (Name)، قم بتعبئة اسم المقايسة (Assay) ثم اضغط على Enter. في المربع أدناه والمسمى النوع (Type)، انقر على القائمة المنسدلة، واختر Channel 2 Unknown ثم اضغط على Enter.

أصبحت الآن جميع المعلومات من الخطوات السابقة موجودة في البئر A1. قم بتسمية جميع الآبار اللاحقة التي تحتوي على قطيرات. ولتوفير وقت الإعداد الكلي، اضغط على مفتاح shift أو control لاختيار عدة آبار في آن واحد. عندما يتطابق التمثيل الرقمي للصفيحة مع الصفيحة المادية، اضغط على OK في أسفل يمين القائمة.

في القائمة الجديدة التي تظهر في الجزء العلوي من المخطط التوضيحي للطبق، اختر "Save As" (حفظ باسم) من قائمة Template (القالب)، ثم قم بتسمية الطبق وحفظه. انقر على "Run" (تشغيل) إلى يسار الشاشة، وحدد مجموعة الصبغة (Dye Set) المناسبة في نافذة Run Options (خيارات التشغيل) المنبثقة. ستبدأ عملية جمع البيانات وسيتم عرضها في الوقت الفعلي في البرنامج.

عندما ينتهي القارئ ويظهر مربع يشير إلى اكتمال التشغيل (Run Complete)، انقر فوق موافق (OK). تحقق من الفصل بين القطيرات الموجبة والسالبة. تأكد من أن الفلورية في جميع القطيرات في آبار NTC قريبة من خط الأساس. انقر فوق الزر المسمى الأحداث (Events).

في الأسفل، انقر فوق المربع المسمى Single، وإلى يمين المخطط البياني (Histogram) المعروض، انقر فوق المربع المسمى Total لعرض العدد الإجمالي للقطرات المقبولة لكل بئر. استبعد أي آبار تحتوي على أقل من 10,000 قطرة عن طريق الضغط باستمرار على مفتاح التحكم (control key) والنقر على الآبار المراد استبعادها. انقر فوق الزر المشار إليه بـ 1D Amplitude لضبط عتبة الفلورة عند انحراف معياري واحد تقريباً للقطرات السالبة في آبار NTC لكلا الهدفين.

في أقصى يسار الشاشة تحت قائمة التحليل التلقائي (Auto Analyze) التي تعرض زرين للعتبة، اختر الأيقونة الموجودة على اليمين والتي يتخللها خط أفقي وردي صلب. انقر فوق المربع الموجود على يسار تعيين العتبة (Set Threshold) أسفل كل من الرسوم البيانية للسعة (Amplitude Graphs) وأدخل قيم عتبة الفلورة المناسبة. بعد ذلك، يتم حساب التركيزات المستهدفة بعدد النسخ لكل ميكرولتر من التفاعل تلقائيًا.

قم بتصدير النتائج في ملف CSV من خلال النقر على زر Export في الزاوية العلوية اليسرى من شاشة 1D Amplitude. في ملف CSV، اضرب تركيز الهدف المُصدّر في أربعة لتحويله من عدد نسخ الهدف لكل µL من التفاعل إلى عدد نسخ الهدف لكل µL من قالب DNA. يقارن هذا الشكل بين تنسيقي duplex و simplex لمقايسة الـ Digital PCR.

تعرض اللوحتان اليسرى واليمنى كميات Enterococcus وHF183 على التوالي، مع معاملات الارتباط المقابلة بين نتائج الفحص المزدوج (duplex) والفحص الأحادي (simplex). تشير الخطوط المتصلة إلى خطوط الانحدار، بينما يشير التظليل الرمادي إلى الأخطاء المعيارية المقابلة. وتُشار الأنواع المختلفة من العينات بواسطة الرموز.

تتسم النتائج باتساق عالٍ وغالباً ما تكون غير قابلة للتمييز سواء تم قياس Enterococcus وHF183 في وقت واحد في تفاعل واحد أو بشكل منفصل في تفاعلين. كما يمكن لمقايسة الـ Digital PCR أن تتحمل وجود المثبطات بتركيزات أعلى بمقدار مرتبة إلى مرتبتين من تلك التي تتحملها نظيراتها من الـ qPCR. يوضح هذا الشكل التقدير الكمي بواسطة qPCR وDigital PCR لعلامة HF183 في حمض نووي مستخلص من مياه صرف صحي نظيفة مضاف إليه تركيزات متزايدة من حمض الهيوميك الذي يثبط عملية الـ PCR.

يتم تعريف التقدير الكمي المتوقع لـ HF183 في غياب المثبطات على أنه فاصل ثقة بنسبة 95% بين الخطين الأفقيين المنقطين. ويستمر تقنية Digital PCR، الممثلة بالمثلثات، في تقديم تقدير كمي دقيق حتى تركيز حمض الهيوميك بمقدار 15 nanograms per microliter للتفاعل، بينما يبدأ qPCR، الممثل بالصلبان، في تقديم تقديرات أقل من القيمة الحقيقية عند 1 nanogram per microliter ويصبح مثبطاً بالكامل عند 5 nanograms per microliter. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء مقايسة HF183 Duplex Droplet Digital PCR هذه أو أي مقايسة مماثلة أخرى باستخدام بادئات ومجسات مختلفة.

منذ تطوير هذا المقايسة المزدوجة (Duplex Assay) التي نُشرت في مجلة Water Research عام 2015، قمنا بتطوير والتحقق من صحة مجموعة كبيرة من مقايسات PCR الرقمية الأخرى التي تستهدف البكتيريا العامة المؤشرة على التلوث البرازي، وعلامات التتبع الميكروبية، والممرضات المنقولة بالمياه. توفر هذه المقايسات تقديرًا كميًا مباشرًا وغير متحيز لأهدافها، وهي أصبحت بدائل مفيدة لمقايسات qPCR في مجال اختبار جودة المياه.