الهندسة الوراثية للأجهزة المعوية الماوس الأولية باستخدام الجسيمات النانوية المغناطيسية تحويل ناقلات الفيروسية للتقسيم المجمدة

نحن نصف تعليمات خطوة بخطوة إلى: 1) هندسة بكفاءة الأعضاء المعوية باستخدام الجسيمات النانوية المغناطيسية للاندوشن لينتي أو الرجعية، و، 2) توليد أقسام المجمدة من الأعضاء المهندسة. ويوفر هذا النهج أداة قوية لتغيير التعبير الجيني بكفاءة في الأعضاء للتحقيق في الآثار النهائية.

لأن organoids خيّر التنظيم الهيكلي الأصلي ، فضلا عن العديد من الميزات الجزيئية للظهارة المعوية في الجسم الحي ، وهذه التقنية تسمح لنا لدراسة علم الأحياء الطبيعي والدول المرض في المختبر. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على هندسة العضيات وراثيا باستخدام نهج تحويل عالي الكفاءة مع انخفاض السمية الخلوية، مما يسمح بإجراء دراسات وظيفية لهذه العضوية التي يتم التلاعب بها وراثيا. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو العلاج لمرض الأمعاء لأننا يمكن أن نعرض الأعضاء المعوية للأدوية وغيرها من العوامل أو التدخلات.

يمكن تطبيق هذه الطريقة لدراسة العمليات التنموية وعلم الأمراض في أنظمة أخرى قابلة للثقافات العضوية، مثل أنسجة الثدي أو الخلايا التي تنمو في ظل ظروف 2D القياسية. عموما، سوف ينجح الأفراد الجدد في هذه الطريقة مع تحويل في الأجهزة التي يصعب هندسها أو الخلايا الأخرى. كان لدينا فكرة لأول مرة لهذه الطريقة عندما واجهنا صعوبات في تحويل organoids والخلايا الجذعية.

إن العرض التوضيحي البصري لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية حيث يمكن أن يحدث فقدان هيكلي للعضيات إذا لم يتم التعامل مع العينات بشكل صحيح أثناء عملية التضمين في مصفوفة الطابق السفلي لتكريبها. لزراعة organoids لtransduction الفيروسية، بذور الثقافات الخلايا العضوية مع 200 ميكرولترات من متوسطة تحويل في بئر في لوحة 48-well، واحتضان في حاضنة ثقافة الأنسجة القياسية. ذوبان قنينات من الفيروس لtransduction، مما يسمح لحوالي 50 ميكرولترات من الفيروس المركزة لtransduction كل بئر في 48-آبار.

في أنبوب 1.5 ملليلتر، اخلطي الفيروس مع 12 ميكرولترات من محلول جسيمات نانوية مغناطيسية، وحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد 15 دقيقة، إضافة حل الجسيمات النانوية المغناطيسية وخليط الفيروس إلى الخلايا التي سيتم تحويلها. ضع لوحة 48-well على لوحة مغناطيسية، واحتضان في حاضنة ثقافة الأنسجة القياسية لمدة ساعتين على الأقل.

عندما يكتمل نقل العدوى الفيروسية، قم بنقل مجموعات الخلايا العضوية المصابة ووسيلة النقل من كل بئر إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي في 500 مرة ز لمدة خمس دقائق. تجاهل supernatant مع شفط لطيف، وتبريد الأنابيب التي تحتوي على بيليه على الجليد لمدة خمس دقائق.

إضافة 120 ميكرولترات من مصفوفة غشاء الطابق السفلي إلى كل أنبوب، وإعادة تعليق بيليه عن طريق الأنابيب ببطء صعودا وهبوطا. بذور 30 ميكرولتر قطرات من خليط الخلية المصفوفية في لوحة جديدة 48 جيدا. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة خمس إلى 15 دقيقة حتى مصفوفة يقوي.

إضافة وسيطة النقل إلى كل بئر، واحتضان في حاضنة زراعة الأنسجة القياسية لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام. بعد ثلاثة إلى أربعة أيام، تفقد الثقافات تحت مجهر خفيف في التكبير 10x لضمان تنظيم مجموعات الخلايا في هياكل الجهاز. استبدال بلطف وسيطة النقل في كل بئر مع 250 ميكرولترات من الاستزراع العضوي ENR المتوسطة.

أعيدوا الصحن إلى الحاضنة. ابدأ هذا الإجراء بإزالة وسيط ENR عن طريق الشفط اللطيف ، مع الحرص على عدم إزعاج مصفوفة الغشاء السفلي. غسل بلطف مع 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني.

إصلاح organoids بإضافة ميكرولتر واحد من 4٪ محلول paraformaldehyde في البئر، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة، إزالة حل paraformaldehyde عن طريق الشفط. إضافة بلطف ميكرولتر واحد من برنامج تلفزيوني في البئر، ومن ثم إزالة برنامج تلفزيوني عن طريق شفط لطيف.

بهذه الطريقة، اغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني. إزالة برنامج تلفزيوني من غسل الثانية، وإضافة ميكرولتر واحد من 30٪ sucrose العازلة لكل عينة. احتضان الأعضاء الثابتة في السكروز لمدة ساعة واحدة في أربع درجات مئوية لتجفيف العينات.

إزالة المخزن المؤقت السكروز عن طريق الشفط، وإضافة مجمع تضمين ما يكفي فقط لتغطية طبقة المصفوفة في كل بئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، ضع العينات في ثلاجة مئوية ناقص 80 درجة لمدة 10 دقائق أو حتى يتحول مركب التضمين إلى صلبة وأبيض.

ضع اللوحة مع مركب التضمين المجمد في درجة حرارة الغرفة للسماح بالحد الأدنى من ذوبان المجمع على طول الحواف. استخدم مشرط أو ملعقة لفصل الكتلة عن جدران البئر. العمل بسرعة لمنع ذوبان، وذلك باستخدام ملقط لإزالة كتلة مجمع المصفوفة تضمين، ووضعها في كتلة عينة.

ملء القالب تماما مع مجمع التضمين. تجميد في ناقص 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل استخدام كتلة للقطع. تم تحسين هذا البروتوكول عن طريق تحويل أول organoids المعوية مع ناقلات العدسي المرتبطة GFP.

تم تصور GFP في كل مرحلة من مراحل التطور العضوي ، بما في ذلك في وقت مبكر عندما تنظم الخلايا سرداب في هياكل تشبه الكيس أو في وقت لاحق عندما تشكل البراعم العضوية. تم بعد ذلك نقل الأعضاء المعوية المستحثة بنجاح بشكل رسمي ثابت ، تم اباكية ، وتحليلها عن طريق تصوير المناعة. في هذه الصورة، النوى ملطخة باللون الأزرق، والأخضر يشير إلى جزيئات التصاق الخلايا الظهارية، التي تحدد حدود الخلية.

يشير اللون الأحمر إلى تلطيخ الليسوسوم لتحديد خلايا بانيث. مرة واحدة يتقن، يمكن إجراء organoids transducing في حوالي ثلاث ساعات، ويمكن أن يتم تضمين النخاع العضوي في حوالي 2 1/2 ساعة. عند محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر للعمل على الجليد عند التعامل مع الكواشف مصفوفة الطابق السفلي.

بعد الانتهاء من هذا الإجراء، يمكن إجراء تحليل الفلورسنت المناعية وغيرها من الطرق للكشف عن البروتينات أو العضيات لتقييم التوطين أو الوفرة النسبية. هذه التقنية تمهد الطريق للباحثين لاستكشاف علم الأحياء الطبيعي والمرض في الدول في المختبر وأيضا في دراسات في الجسم الحي إذا كان organoids أو الخلايا المستحثة يمكن زرعها في الفئران. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام الفيروسات التي تحمل علامة مغناطيسية لهندسة organoids وراثيا للتبريد.

يرجى عدم نسيان أن العمل مع الفيروسات يمكن أن يكون خطيرا للغاية، وينبغي اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معدات واقية مناسبة دائما عند تنفيذ هذا الإجراء.