بروتوكول لعدة خروج المغلوب الجيني في ماوس الأورغانويدات المعوية الصغيرة باستخدام كريسبر-كونكاتيمر

الهدف العام من هذا البروتوكول ، هو استنساخ الحمض النووي الريبي المتعدد في ناقل CRISPR-concatemer واحد وتحقيق التثقيب الكهربائي عالي الكفاءة في العضيات المعوية للفأر ، من أجل الحصول على ضربة قاضية متزامنة لجينات متعددة. يمكن لهذه الطريقة أن تحسن بشكل كبير من كفاءة دراسات الوظائف المفقودة من خلال جعل من الممكن التغلب على التأثير المحتمل للتعويض الموازي. تتمثل الميزة الرئيسية لاستراتيجية CRISPR-concatemer الخاصة بنا في راحة خطوة استنساخ واحدة وإمكانية إجراء ضربة قاضية متزامنة لما يصل إلى أربعة جينات مختلفة.

توضيح الإجراء من قبل أليساندرا ميريندا ، طالبة دكتوراه من مختبري. يبدأ استنساخ الحمض النووي الريبي الإرشادي أو الحمض النووي الريبي في ناقل CRISPR-concatemer بتفاعل واحد لتلدين الخيوط العلوية والسفلية لكل قليل النوكليوتيد gRNA وفسفرة نهايتها. قم بإعداد خليط التفاعل على الجليد ، لثلاثة كتلات ، استخدم ثلاثة ميكرولترات من gRNAs العلوية ، وثلاثة ميكرولترات من gRNAs للخيط السفلي ، وميكرولترين من T4 DNA ligase buffer ، وميكرولتر واحد من T4 عديد النوكليوتيدات كيناز والماء يصل حجمه الإجمالي إلى 20 ميكرولترا.

امزج جيدا عن طريق سحب العينة وتشغيل جهاز التدوير الحراري باستخدام الإعدادات التالية ، 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، منحدر إلى 25 درجة مئوية عند 0.3 درجة مئوية في الدقيقة وثباته عند أربع درجات مئوية. الخطوة التالية هي تفاعل خلط Bbs1 ، حيث يتم دمج قليل النوكليوتيدات gRNA الملدنة مسبقا في الموضع المناسب للناقل المتسلسل. خفف خليط التفاعل من واحد إلى 100 في الحمض النووي ، الماء الحر من الحمض النووي الريبي لتوليد ثلاثة وأربعة نواقل gRNA متسلسلة.

قم بتجميع تفاعلات خلط Bbs1 على الجليد. استخدم 100 نانوجرام من ناقل CRISPR-concatemer ، و 10 ميكرولتر من خليط oligo ، وميكرولتر واحد من مخزن إنزيم التقييد ، وميكرولتر واحد من DTT ، وميكرولتر واحد من ATP ، وميكرولتر واحد من إنزيم Bbs1 ، وميكرولتر واحد من T7 ligase وماء يصل حجمه الإجمالي إلى 20 ميكرولترا. امزج جيدا عن طريق سحب العينات، وقم بتضمين عنصر تحكم سلبي يحتوي على المتجه.

قم بتشغيل التفاعلات في مدورة حرارية ، باستخدام الإعدادات التالية ، لاستنساخ ثلاثة وأربعة مسلسلات gRNA ، قم بتشغيل 50 دورة عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق و 21 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، واستمر عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ثم احتفظ بها عند أربع درجات مئوية إلى أجل غير مسمى. بالنسبة لاثنين من سلسلة gRNA ، قم بتشغيل نفس الإعدادات مع 25 دورة من الخطوة الأولى. عند اكتمال تفاعل خلط Bbs1 ، خذ 11 ميكرولترا من كل مزيج ربط وأضف 1.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنوكلياز الخارجي ، و 1.5 ميكرولتر من ATP ، وميكرولتر واحد من نوكلياز الحمض النووي والماء إلى الحجم الإجمالي 15 ميكرولترا.

احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة متبوعة ب 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، يتم استخدام خليط التفاعل لتحويل بكتيريا الإشريكية القولونية المختصة كيميائيا ، باتباع بروتوكول قياسي. لتأكيد وجود إدخالات gRNA في ناقل CRISPR-concatemer ، اختر مستعمرات البكتيريا بحلقة تلقيح وتلقيح كل منها في أربعة ملليلتر من وسط LB.

قم بزراعة المستنسخة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في شاكر مداري. في اليوم التالي ، يتم استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة أدوات التحضير المصغرة للبلازميد ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. امزج ما يقرب من 200 نانوجرام من كل عينة من الحمض النووي مع 10 وحدات من EcoR1 وخمس وحدات من BglII في تفاعل 10 ميكرولتر.

قم بتضمين خليط تفاعل منفصل مع المتجه الأصلي المقابل كعنصر تحكم إيجابي لمقارنة الحجم. احتضان التفاعلات عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. قم بتشغيل تفاعلات الهضم على هلام الاغاروز 1٪ عند 90 فولت لمدة 20 دقيقة تقريبا.

تصور الجل باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية لتحديد المستنسخة بحجم الإدخال الصحيح. للتأكد من أن gRNAs قد تم استنساخها في الموضع الصحيح وبالتالي فقد جميع مواقع التعرف على Bbs1 ، استوعب المستنسخة المحددة بخمس وحدات من Bbs1. قم بتضمين مزيج تفاعل منفصل ، مع المتجه الأصلي المقابل كعنصر تحكم.

احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات ، وقم بتشغيل تفاعلات الهضم على هلام الاغاروز 1٪ عند 90 فولت لمدة 20 دقيقة تقريبا. تصور الجل باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية لتحديد النواقل التي لم يتم قطعها بواسطة Bbs1. عند تقسيم العضيات للتثقيب الكهربائي ، قم بزرع ما لا يقل عن ستة آبار من صفيحة 48 بئر لكل نقل.

قم بزرع العضيات في 20 ميكرولتر من قطرات مصفوفة الطابق السفلي وزراعتها في 250 ميكرولتر من WENR بالإضافة إلى وسط النيكوتيناميد لكل بئر عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في حاضنة مرطبة. في اليوم الثاني ، استبدل وسط WENR بالإضافة إلى النيكوتيناميد ب 250 ميكرولتر من EGF بالإضافة إلى noggin ومثبط GSK3 ووسط مثبط الصخور بدون مضادات حيوية. في اليوم الثالث ، قم بتغيير الوسط العضوي إلى EGF بالإضافة إلى noggin ومثبط GSK3 ومثبط الصخور و 1.25٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد بدون مضادات حيوية.

في اليوم الرابع ، قم بتعطيل قباب مصفوفة الطابق السفلي ، باستخدام طرف ماصة سعة مليلتر واحد وانقل العضيات إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. اسحب محتويات أربعة آبار من صفيحة 48 بئر في أنبوب واحد. قم بتقسيم العضيات ميكانيكيا إلى شظايا صغيرة عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة P200 حوالي 200 مرة.

جهاز طرد مركزي عند 600 مرة جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة الوسيط من جميع الأنابيب وأعد تعليق اللوحات في مليلتر واحد من البروتياز المؤتلف بدرجة زراعة الخلايا. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة أقصاها خمس دقائق.

من المهم مراقبة علاج البروتياز بعناية لأن نجاح التثقيب الكهربائي يعتمد على الحصول على معلق خلوي يحتوي على مجموعات من الخلايا بدلا من الخلايا المفردة. تحقق من قطرة 50 ميكرولتر من العينة تحت مجهر ضوئي مقلوب بهدف أربع مرات. من المستحسن وجود مجموعات من 10 إلى 15 خلية لأن هذا يزيد من بقاء الخلية بعد التثقيب الكهربائي.

انقل تعليق الخلية إلى أنبوب منخفض الارتباط سعة 15 مليلتر وخنزير التفكك عن طريق إضافة تسعة ملليلتر من الوسط القاعدي بدون مضادات حيوية. قم بجهاز الطرد المركزي عند 600 مرة جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق اللوحة في ملليلتر واحد من وسط المصل المخفف.

احسب عدد الخلايا التي تحتوي على حجرة بوركس ، هناك حاجة إلى ما لا يقل عن 10 في الخلايا الخامسة لكل تفاعل كهربائي. ابدأ هذا الإجراء بإضافة تسعة ملليلتر من وسط المصل المخفض إلى أنبوب 15 مليلتر الذي يحتوي على معلق الخلية وجهاز الطرد المركزي عند 400 مرة G لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة كل المادة الطافية وأعد تعليق اللوحة في محلول التثقيب الكهربائي.

أضف كمية إجمالية قدرها 10 ميكروغرامات من الحمض النووي إلى أنبوبين جديدين. بعد ذلك ، أضف محلول التثقيب الكهربائي إلى الحجم النهائي البالغ 100 ميكرولتر واحتفظ بخليط الحمض النووي للخلية على الجليد. انقل خليط الحمض النووي للخلية إلى كوفيت التثقيب الكهربائي ، ضع الكوفيت في غرفة المثق الكهربائي.

قم بقياس المعاوقة بالضغط على الزر المناسب على المثقب الكهربائي وتأكد من أنه من 0.030 إلى 0.055 أوم. قم بإجراء التثقيب الكهربائي وفقا للإعدادات الموضحة في بروتوكول النص. أضف 400 ميكرولتر من مخزن التثقيب الكهربائي بالإضافة إلى مثبط الصخور إلى الكوفيت ثم انقل جميع محتوياته إلى أنبوب سعة 1.5 مل.

احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة للسماح للخلايا بالتعافي. بعد 30 دقيقة ، قم بالدوران عند 400 مرة جم لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق اللوحة في 20 ميكرولترا لكل بئر من مصفوفة الطابق السفلي.

قم بالبذور تقريبا مرة واحدة في 10 إلى الرابع إلى واحد في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر في صفيحة 48 بئر وأضف EGF بالإضافة إلى noggin ومثبط GSK3 ومثبط الصخور و 1.25٪ وسط ثنائي ميثيل سلفوكسيد. احتضان عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، قم بتغيير الوسط إلى EGF بالإضافة إلى noggin ومثبط GSK3 ومثبط الصخور وتحقق من كفاءة النقل من خلال مراقبة تعبير GFP.

حافظ على العضيات عند 37 درجة مئوية. بعد يومين ، استبدل الوسط بوسط طازج. بعد أربعة أيام من التثقيب الكهربائي ، قم بتغيير الوسط إلى WENR بالإضافة إلى النيكوتيناميد ووسط مثبط الصخور واستمر في احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية.

يتم تأكيد وجود العدد الصحيح من إدخالات gRNA في ناقل التسلسل من خلال الهضم المزدوج مع EcoR1 و BglII. الحجم المتوقع للنطاق السفلي هو حوالي 1.6 كيلو قاعدة لمتجه متسلسل بأربعة gRNA و 1.2 كيلو قاعدة لناقل متسلسل ثلاثي gRNA. بالإضافة إلى ذلك ، يؤكد الهضم باستخدام Bbs1 أنه تم استنساخ gRNAs في الموضع الصحيح وبالتالي ، يتم فقد جميع مواقع التعرف على Bbs1.

يتم تسليم التركيبات المؤكدة إلى العضيات المعوية للفأر عن طريق التثقيب الكهربائي لتحقيق كفاءة نقل تصل إلى 70٪ كما هو موضح في تعبير GFP. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد نواقل الحمض النووي الريبي المتسلسلة وكيفية توصيلها بكفاءة إلى الثقافات العضوية ثلاثية الأبعاد باستخدام التثقيب الكهربائي ، من أجل تحقيق ضربة قاضية لجينات متعددة في نفس الوقت.