توصيف والعزلة للماوس Microglia الأولية بكثافة التدرج الطرد المركزي

الهدف العام من هذا البروتوكول هو عزل مجموعة عالية النقاء من الخلايا الدبقية الصغيرة عن القوارض. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال المعلومات العصبية مثل تحديد الخصائص المناعية للخلايا الجذعية على الخلايا الدبقية الصغيرة أو إجراء فحوصات فحص الأدوية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي عزل مجموعة عالية النقاء من الخلايا الدبقية الصغيرة دون الحاجة إلى وقت طويل في الثقافة.

لبدء هذا الإجراء ، أدخل أطراف المقص من خلال الفتحة الموجودة في القناة الشوكية وقم بعمل شقوق جانبية في قناة الأذن. ثم حرك الأنسجة برفق باتجاه المنصة لكشف الجمجمة. بعد ذلك ، قم بعمل شق على طول الخيط السهمي باتجاه البرجما.

ثم أدخل طرف المقص في بريغما وقم بعمل شقوق جانبية. بعد ذلك ، قشر الجمجمة برفق لكشف الدماغ. باستخدام ملقط منحني ، قم بإزالته ونقله إلى وعاء معقم سعة خمسة ملليلتر.

اغسلها مرتين إلى ثلاث مرات بخمسة ملليلتر من وسائط الغسيل المثلجة لكل غسلة لإزالة الدم. في غطاء تدفق الهواء الرقائقي ، ضع محتويات الحاوية سعة خمسة ملليلتر في طبق بتري صغير يستريح على الثلج. باستخدام شفرة مشرط معقمة أو مقص معقم ، قم بإزالة المخيخ والبصلة الشمية.

ثم قم بعمل قطع خط الوسط لفصل نصفي الكرة الأرضية. بعد ذلك ، حدد الطبقة السحائية على أنها طبقة رقيقة جدا من الخلايا ذات مسحة حمراء على سطح الدماغ مع أوعية دموية مرئية. قشر الطبقة السحائية بعناية باستخدام ملقط ناعم مع الحرص على عدم إتلاف القشرية.

إذا انكسرت الطبقة السحائية ، استمر في تقشير الشظايا الممزقة حتى يتم إزالتها تماما. بعد ذلك ، انقل نصفي الكرة الأرضية إلى طبق بتري صغير جديد على الثلج واملأه بوسائط الغسيل. يقطع الدماغ إلى قطع صغيرة بشفرة مشرط معقمة.

بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من غراء و 150 ميكرولتر من DNase1 في الوسائط واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد الهضم ، قم بتقطيع الأنسجة باستخدام ماصة P1000. إذا كانت قطع المناديل كبيرة جدا بحيث لا يمكن لدخول الماصة، ففكر في استخدام زوج من المقصات المعقمة لتوسيع طرف الماصة.

خلال هذه العملية ، احرص على عدم إدخال الفقاعات في الوسائط لأن ذلك قد يقلل من صلاحية الخلية. في غطاء التدفق الصفحي ، قم بإعداد أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر بمصفاة خلية 100 ميكرومتر. صب وسط الهضم وقطع الدماغ على المصفاة.

ادفع من خلال قطع الدماغ باستخدام مكبس حقنة معقمة سعة ثلاثة ملليلتر في حركة طحن حتى لا يكون هناك المزيد من الأنسجة المرئية. اغسل الفلتر باستمرار بوسائط الغسيل طوال هذه العملية. سوف يغسل هذا من خلال أي خلايا محاصرة في المصفاة.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لنظام التعليق أحادي الخلية عند 500 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بإعداد Percoll متساوي التوتر عن طريق إضافة نسبة تسعة إلى واحد من وسط تدرج الكثافة إلى HBSS المعقم 10X. إعداد التدرجات اللونية على أنها 30٪ SIP في DMEM و 70٪ SIP في HBSS واحد X.

على سبيل المثال ، لتحضير 10 ملليلتر من 30٪ SIP ، أضف ثلاثة ملليلتر من SIP إلى سبعة ملليلتر من DMEM. بعد ذلك ، قم بشفط المادة الطافية من الأنبوب المخروطي وأعد تعليق حبيبات الخلية بثمانية ملليلتر من 30٪ SIP في DMEM. انقل الحجم الكامل إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل.

بعد ذلك، قم بوضع أساس محلول SIP بنسبة 70٪ عن طريق ملء ماصة النقل بنسبة 70٪ SIP ودفع ماصة النقل بعناية إلى قاع الأنبوب المخروطي. بمجرد أن يقترب الطرف من القاع، ادفع المحتويات برفق عبر ماصة النقل. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لطبقات SIP بما في ذلك الخلايا عند 650 G مع صفر الفرامل والتسارع الرابع لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

يجب أن تكون طبقة Percoll 70٪ تحت الأساس بعناية فائقة. يمكن أن يؤثر تعطيل هذه الواجهة بشدة على محاصرة الخلايا الدبقية الصغيرة في طبقة الخلية ويقلل بشدة من الغلة. بعد ذلك ، قم بشفط أربعة ملليلتر من الوسائط بالحطام الخلوي من أعلى الأنبوب لتسهيل إزالة الخلايا أحادية النواة في الخطوة التالية.

بعد ذلك، قم بخفض طرف الماصة بعناية باتجاه الواجهة وعزل الخلايا أحادية النواة عن الواجهة المتوسطة المتدرجة بكثافة 30/70. اجمع ما يقرب من ثلاثة ملليلتر من الواجهة الغائمة وانقلها إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل. بعد ذلك ، قم بتخفيف الخليط بتسعة ملليلتر من HBSS للمساعدة في إزالة وسط تدرج الكثافة.

جهاز الطرد المركزي واجهة وسيط التدرج المخفف الكثافة التي تحتوي على الخلايا أحادية النواة عند 500 جم لمدة خمس دقائق. استنشق المادة الطافية وأعد تعليقها بملليلتر واحد من وسط النمو. بعد ذلك ، قم بتلطيخ الخلايا المعاد تعليقها باستخدام Trypan blue وقم بإجراء تعداد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم.

في هذه الخطوة ، قم بالطرد المركزي للخلايا أحادية النواة المجمعة عند 300 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية لإزالة وسط النمو لأن هذا سيتداخل مع العزل المغناطيسي. باستخدام نفس عدد الخلايا الذي تم الحصول عليه سابقا ، أعد تعليقه مرة واحدة 10 إلى ثماني خلايا نواة لكل مليلتر في PBS الذي يحتوي على 2٪ FBS و EDTA واحد مليمولار ضمن نطاق حجم يتراوح من 0.1 إلى 2.5 ملليلتر. بعد ذلك ، أضف الحجم الكامل للخلايا ذات النواة في PBS إلى أنبوب دائري القاع من البوليسترين جديد سعة خمسة ملليلتر.

ثم أضف 50 ميكرولترا من كاشف وضع العلامات CD11b PE لكل مليلتر واحد من العينة. احتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة محميا من الضوء. بعد ذلك ، أضف 70 ميكرولترا من كوكتيل الاختيار لكل مليلتر واحد من العينة.

احتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة محميا من الضوء. بعد ذلك ، قم بخلط الجسيمات المغناطيسية عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل أكثر من خمس مرات. أضف 50 ميكرولتر لكل مليلتر إلى العينة واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق محمية من الضوء.

إذا كان الحجم الإجمالي لخليط الخلية أقل من 2.5 ملليلتر، فقم بتعبئة هذا الحجم باستخدام PBS الذي يحتوي على 2٪ FBS و EDTA واحد مليمول وخلطه عن طريق الماصة برفق مرتين إلى ثلاث مرات. ثم ضع الأنبوب في المغناطيس واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. في حركة واحدة مستمرة ، قم بقلب المغناطيس الذي يحتوي على الأنبوب بالكامل لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان لصب المادة الطافية.

أعد المغناطيس إلى وضع رأسي وقم بإزالة الأنبوب من المغناطيس. بعد ذلك ، اغسل الخلايا المتبقية من العمود عن طريق تكرار الإجراءات. أعد تعليق الخلايا في وسط النمو المطلوب.

اشطف جانب وعاء التجميع لجمع الخلايا من جوانب الأنبوب وزيادة الغلة. كما يتضح من هذا الشكل ، تحتفظ الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية المعزولة بجسم الخلية الكروي وهيكلها المتشعب المميز. فيما يلي مخططات الحقائق التمثيلية للخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة.

يسمح التلوين المشترك للملحقين V ويوديد البروبيديوم بتصنيف الخلايا المبرمج أو النخرية أو الحية بعد التحفيز باستخدام LPS. قلل الوسط المكيف hAEC بشكل كبير من موت الخلايا الخلايا الخلايا الخلايا الدبقية الصغيرة بالنسبة للضوابط التي تشير إلى شكل من أشكال الحماية على هذا النوع من الخلايا. بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون ست إلى ثماني ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

عند تنفيذ هذه الطريقة ، من المهم توخي الحذر الشديد في وضع طبقات من Percoll لأن هذه الخطوة سيكون لها أكبر تأثير على الغلة. باتباع هذه التقنية ، يمكن استخدام إجراءات أخرى مثل مقايسة وظيفة البلعمة ، أو الزراعة المشتركة مع الخلايا العصبية ، للإجابة على أسئلة إضافية حول الخصائص المناعية لنوع الخلية التي تختارها على الخلايا الدبقية الدقيقة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في هذا المجال لاكتشاف كيف يمكن تعديل الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية في إصابات الدماغ في الفترة المحيطة بالولادة.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو علاج وتشخيص إصابات الدماغ في الفترة المحيطة بالولادة لأنها تسمح بتوصيف نوع الخلايا المناعية الأولية المعروفة بمشاركتها في المعلومات العصبية التي تؤدي إلى خلل وظيفي حركي ومعرفي. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للاضطرابات الحركية مثل الشلل الدماغي ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على اضطرابات أخرى حيث تلعب الخلايا الدبقية الصغيرة دورا في التسبب في التسبب مثل مرض الزهايمر. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما أردنا تقنية للتوصيف السريع للخلايا الدبقية الصغيرة التي تتحايل على التغيرات اللاجينية المحتملة بعد وقت طويل في الثقافة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل السكان الدبقيين الصغيرة عالية النقاء لتوصيف المصب.