عزل الخلايا الدبقية الصغيرة من الآفات المزيلة للميالين في دماغ الفأر باستخدام فرز الخلايا المنشطة المغناطيسية

تشريح الآفات الميزيلة للميالين الملطخة من الجسم الثفني لدماغ الفأر.

تحتوي هذه الآفات على الخلايا الدبقية الصغيرة المقيمة في الدماغ التي تعبر عن الإنتجرين على سطح الخلية CD11b.

اجمع الأنسجة وأضف محلولا يحتوي على إنزيم محلل للبروتين و DNase.

يحلل الإنزيم المصفوفة خارج الخلية ، بينما يحلل DNase الحمض النووي الحر.

أضف عازلة باردة وقم بتصفية التعليق من خلال مصفاة لإزالة الكتل الخلوية.

جهاز الطرد المركزي ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا المحببة في وسط تدرج كثافة.

تراكب مع عازلة وجهاز طرد مركزي لجمع الحطام المتبقي في الطبقات العليا ؛ تستقر الخلايا السليمة في الأسفل.

قم بإزالة الحطام وإعادة تعليق الخلايا في مخزن مؤقت.

أضف حبات مغناطيسية مضادة ل CD11b لتسمية الخلايا الدبقية الصغيرة.

قم بتحميل الخلايا على عمود يحتوي على كرات مغناطيسية حديدية موضوعة في المجال المغناطيسي للفاصل المغناطيسي.

تحت المجال المغناطيسي الخارجي ، يتم الاحتفاظ بالخلايا الدبقية الصغيرة المرتبطة بالخرزة في العمود بينما تتدفق الخلايا غير المنضمة من خلاله.

قم بإزالة العمود من المجال المغناطيسي. أضف عازلة لمسح الخلايا الدبقية الصغيرة.

ابدأ بالتشريح الدقيق للآفات الموسوة بصبغة محايدة حول الجسم الثفني تحت مجهر مجسم. قم بالطرد المركزي للأنسجة المقطعة عند 300 × جم لمدة 30 ثانية لجمع العينة في قاع الأنبوب. يسخن مزيج الإنزيم 1 ومزيج الإنزيم من 2 إلى 37 درجة مئوية في حاضنة. بعد ذلك ، أضف 1,950 ميكرولتر من مزيج الإنزيم المسخن مسبقا 1 إلى عينة واحدة وهضمه في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أضف 30 ميكرولترا من مزيج الإنزيم المسخن مسبقا 2 ، واخلطه برفق.

بعد الهضم ، أضف 4 مل من PBS البارد إلى الأنبوب ، ورجه برفق. قم بالطرد المركزي لعينات الأنسجة عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وشفط المادة الطافية ببطء وبشكل كامل. أعد تعليق حبيبات الخلية برفق باستخدام 1,550 ميكرولتر من PBS البارد. أضف 450 ميكرولتر من المحلول البارد لإزالة الحطام واخلطه جيدا.

استخدم ماصة سعة 1000 ميكرولتر لتراكب الخليط ببطء شديد وبلطف، مع 2 مل من PBS البارد. جهاز الطرد المركزي ، الخليط ثم ابحث عن 3 طبقات. استخدم ماصة سعة 1000 ميكرولتر لشفط الطبقتين العلويين بالكامل، واملأ الأنبوب حتى 5 ملليلتر بمخزن مؤقت للتحميل البارد. اقلب الأنبوب برفق 3 مرات.

بعد ذلك ، بعد الطرد المركزي وشفط المادة الطافية ، قم بتعليق حبيبات الخلية ب 90 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحميل ، وأضف 10 ميكرولترات من حبات CD11b. تخلط جيدا وتحتضن لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. بعد الحضانة ، أضف 1 مليلتر من مخزن التحميل المؤقت ، واغسل الخلايا عن طريق سحب السائل برفق لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر.

قم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4:00 درجة مئوية ، وشفط المادة الطافية تماما لإزالة الخرزات غير المقيدة. أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحميل ، وضع عمود MS مع الفاصل الخاص به للاختيار الإيجابي في المجال المغناطيسي. اشطف العمود ب 500 ميكرولتر من مخزن التحميل لحماية الخلايا ، وضمان كفاءة الفرز المغناطيسي بناء على بروتوكول الشركة المصنعة.

قم بتطبيق تعليق الخلية على عمود MS ، وتخلص من التدفق الذي يحتوي على الخلايا غير المسماة. أضف 500 ميكرولتر من مخزن التحميل لغسل العمود ، وقم بإزالته من الفاصل. ضع العمود على أنبوب طرد مركزي سعة 15 مليلتر وأضف 1 مليلتر من مخزن التحميل المؤقت إلى العمود. أخيرا ، ادفع المكبس إلى أسفل العمود لطرد الخلايا ذات العلامات المغناطيسية.