عزل الخلايا أحادية النواة عن دماغ الفأر: تقنية الطرد المركزي المتدرج للكثافة لعزل الخلايا أحادية النواة المقيمة في الدماغ

تلعب الخلايا أحادية النواة في الدماغ ، التي تتكون من الخلايا الليمفاوية والخلايا الوحيدة ، أدوارا حاسمة في الحفاظ على وظائف المخ والتوازن.

لعزل هذه الخلايا أحادية النواة ، أولا ، خذ دماغ فأر تم حصاده حديثا مملوءا بالمحلول الملحي.

يسمح التروية بإزالة الدم ومكوناته من الأوعية الدموية ، مما يتيح عزل الخلايا المناعية المقيمة في الدماغ في الخطوات اللاحقة.

الآن ، اشطف الدماغ بوسائط مناسبة لإزالة خلايا الدم الحمراء الملتصقة. تابع الشطف بالفرم للحصول على قطع صغيرة من المناديل.

تجانس قطع الأنسجة للحصول على تعليق من الخلايا المفردة وشظايا الخلايا.

إلى هذا التعليق ، ثم أضف الوسائط المبردة ووسط تدرج الكثافة المناسب بأحجام مناسبة لتشكيل وسط تدرج منخفض الكثافة.

بعد ذلك ، أضف حجما معينا لوسط تدرج عالي الكثافة ؛ تشكل وسائط التدرج عالية الكثافة طبقة منفصلة في الأسفل ، مما يخلق تدرجا متقطعا للكثافة.

الطرد المركزي التعليق بسرعة عالية وظروف درجات الحرارة المنخفضة. تحتل الخلايا أحادية النواة الواجهة بين طبقتي وسائط تدرج الكثافة.

تخلص من الطبقة العليا التي تحتوي على الحطام الخلوي والمايلين - غمد الأنسجة الدهنية المحيط بمحاور الخلايا العصبية.

انقل طبقة الواجهة إلى أنبوب جديد يحتوي على وسائط مناسبة وجهاز طرد مركزي.

تضع الخلايا أحادية النواة المنقاة رواسب على شكل حبيبات ويمكن إعادة تعليقها في مخزن مؤقت لمزيد من التحليل.

اقطع الجمجمة بعناية من الأنف إلى الرقبة وانقل دماغ كل من صندوق الجمجمة إلى أنابيب فردية سعة 50 مليلتر تحتوي على 10 مل من وسط RPMI.

امزج الأنابيب جيدا لإزالة خلايا الدم الحمراء الملتصقة وإزالة الوسط عن طريق الشفط. أضف 10 مل من الوسط الطازج إلى كل أنبوب وانقل الأدمغة إلى أطباق فردية بحجم 100 ملم.

قم بتقطيع كل دماغ جيدا بشفرة حلاقة واستخدم ماصة بلاستيكية لنقل أكبر قدر ممكن من الأنسجة من طبق واحد في كل مرة في 6 ملليلتر من المتوسط إلى الخالط الزجاجي الملبد سعة 7 ملليلتر.

اطحن الدماغ باستخدام المكبس "السائب" للمدقة قبل استخدام المكبس "الضيق" لإحضار الأنسجة حتى يصبح التعليق متجانسا. ثم اسكب ملاط الأنسجة الناتج في أنبوب مخروطي الشكل سعة 15 مليلتر مبرد مسبقا على الجليد.

عندما يتم تجانس جميع العينات ، اضبط الحجم في كل أنبوب إلى 7 ملليلتر بوسط جديد قبل إضافة كل تعليق من الأنسجة إلى أنبوب جديد مبرد سعة 15 مليلتر يحتوي على 3 ملليلتر من مصفوفة الغشاء القاعدي بنسبة 100٪ لكل أنبوب.

امزج عن طريق الانعكاس عدة مرات واستخدم ماصة سعة 3 ملليلتر لإضافة 1 ملليلتر من محلول التدرج الكثافة بنسبة 70٪ بعناية وببطء تحت كل عينة من محلول الأنسجة.

افصل الخلايا عن طريق الطرد المركزي المتدرج للكثافة وقم بإزالة كل الطبقة العليا تقريبا ، مع الحرص على إزالة كل المايلين تماما.

انقل الواجهة إلى أنبوب جديد سعة 15 مليلتر واضبط مستوى الصوت على 10 مل مع وسط جديد. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينات مرة أخرى وقم بإزالة المادة الطافية قبل تعليق الكريات في حوالي 100 ميكرولتر من الوسط لكل أنبوب.