الاستخدام العملي لتدخل الجيش الملكي النيبالي: التسليم الشفوي من الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل في ناقلات الحويصلية للصراصير

الهدف العام من هذا البروتوكول هو استنفاد التعبير الجيني في أمعاء الصراصير باستخدام تداخل الحمض النووي الريبي عن طريق الابتلاع الفموي للحمض النووي الريبي مزدوج الشريطة مغلف في ناقلات الجسيمات الشحمية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في تطوير طرق جديدة لمكافحة الآفات ، مثل هل يمكن أن يؤدي تدمير الجينات الأساسية في الحقول المفتوحة إلى قتل الآفات؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الجسيمات الشحمية تحمي الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل الخاص بالجين لضمان توصيله إلى الخلية المستهدفة.

سيوضح الإجراء جيا هسين هوانغ ، باحث ما بعد الدكتوراه ، ويون ليو ، فني من مختبري. للبدء ، قم بتخدير الصراصير على الجليد حتى لا تتحرك لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك ، التقط حشرة باستخدام الإبهام والسبابة للوصول إلى جانبها البطني.

بعد ذلك ، استخدم مقص تشريح لقطع طرف كوكسا من الساق الخلفية بين كوكسا والمدور المدور. يعد القطع في مكان آخر على كوكسا أقل كفاءة لمجموعات الهيموليمف. الآن ، ضع ماصة دقيقة سعة 10 ميكرولتر عند الشق ، واضغط على البطن برفق أثناء سحب الهيموليفف النازف.

كرر هذه العملية حتى يتم جمع الهيموليمف من خمسة صراصير في أنبوب طرد مركزي واحد دقيق. بعد ذلك ، قم بتدوير الهيموليمف المجمع لفترة وجيزة لمدة 10 ثوان. ثم امزج 10 ميكرولترات من الهيموليمف مع 50 ميكرولتر من محلول ملحي للحشرات 1x.

الآن ، قم بالطرد المركزي للهيموليمف المخفف لمدة 10 دقائق لسحب الخلايا الدموية من المحلول. ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد. أخيرا ، حدد تركيز البروتين الكلي باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية المرئية الحجم ، واضبط تركيز كل عينة على ستة ملليغرام من البروتين لكل ميكرولتر.

لجمع عصير الأمعاء الوسطى ، أولا ، قم بتخدير الصراصير على الثلج. بعد ذلك ، انقل واحدة إلى لوحة تشريح محملة بمحلول ملحي بارد 1x للحشرات ، واستخدم دبابيس الحشرات لتثبيتها على الجانب البطني لأعلى. الآن ، قم بتشريح البطن باستخدام ملاقط دقيقة.

ثم قم بإزالة القناة الهضمية بالكامل ، وانقلها إلى طبق طازج مع محلول ملحي للحشرات 1x. بعد ذلك ، اعزل المعى المتوسط ، وهي المنطقة الواقعة بين المحصول والأنابيب Malpighian. للقيام بذلك ، قم بإزالة الجزء الأمامي من وإزالة الأمعاء الخلفية.

بعد ذلك ، انقل الأمعاء الوسطى بسرعة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق مع 100 ميكرولتر من محلول ملحي للحشرات. اجمع الأمعاء الوسطى من ستة صراصير في نفس الأنبوب. ثم قم بتدوير الأنبوب لمدة 10 ثوان.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخليط لمدة 10 دقائق لفصل الخلايا الدموية وأنسجة الأمعاء. بعد ذلك ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب نظيف للطرد المركزي الدقيق ، واضبط التركيز على ستة ملليغرام من البروتين لكل ميكرولتر. يجب استخدام ضبابات الحمض النووي الريبي مزدوجة الشريطة في غضون ساعة من التحضير.

أثناء تحضيرها ، تأكد من الجمع بين كل الكاشف المخفف مع الحمض النووي الريبي المخفف مزدوج الشريطة في نفس الوقت. ثم ، دوامة بسرعة واحتضان الخليط. بمجرد أن تصبح جاهزا ، امزج أربعة ميكرولترات من محلول الحمض النووي الريبي مزدوج الشريطة مع 10 ميكرولتر من محلول ملحي للحشرات كعنصر تحكم ، أو امزجه مع 10 ميكرولتر من الإنزيمات المستخرجة المأخوذة من عصير الهيمولينف أو عصير الأمعاء الوسطى.

بعد ذلك ، قم بعمل تحكم مثبط للإنزيم عن طريق إضافة ميكرولترين من EGTA. خلاف ذلك ، أضف ميكرولترين من الماء الخالي من RNase. ثم احتضان العينات لمدة ساعة أو أكثر عند 25 درجة مئوية.

بعد الحضانة ، أضف 200 ميكرولتر من كاشف الاستخراج و 40 ميكرولتر من الكلوروفورم ، ثم دوامة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينات لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، انقل 150 ميكرولترا من كل مادة طافية إلى أنبوب جديد ، وقم بترسيب الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل من كل عينة عن طريق إضافة 150 ميكرولترا من الأيزوبروبانول واحتضان العينات على الجليد لمدة 15 دقيقة.

بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للعينات مرة أخرى وتخلص من المادة الطافية. ثم, اغسل كريات الحمض النووي الريبي مرتين عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من 70٪ الإيثانول إلى كل حبيبات والطرد المركزي للأنبوب. بعد الغسيل الثاني ، جفف كريات الحمض النووي الريبي مزدوجة الشريطة باستخدام مكثف فراغ الطرد المركزي لمدة ثلاث دقائق.

بعد ذلك ، أعد تعليق الكريات في 10 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase. أخيرا ، تحقق من سلامة الحمض النووي الريبي المزدوج المعالج باستخدام هلام الاغاروز بنسبة 1.5٪. أطعم الصراصير مرتين يوميا ، بعد ساعة واحدة من إضاءة الأضواء وساعة واحدة قبل إطفاء الأنوار.

افعل ذلك لمدة ثمانية أو 16 يوما دون انقطاع. خلال هذا الوقت ، يجب تجويع الصراصير من الماء. للتغذية ، لديك شرائح حمض مضمضة مزدوجة الشريطة من الحمض النووي الريبي المحضرة حديثا والحمض النووي الريبي مزدوج الشريطة عارية متاحة.

بالنسبة للبلعة ، استخدم مع أربعة ميكرولترات من الدهون الحمضية المربية مزدوجة الشريطة أو 250 نانوغرام من الحمض النووي الريبي العاري مزدوج الشريطة. لإطعام صرصور ، أولا ، أمسكها من الأجنحة باستخدام ملقط مرن. لا تمسك بأجزاء جسم الصرصور.

بعد ذلك ، قم ببسط قطرة المحلول ببطء بالقرب من أجزاء الفم ، وشاهد الصرصور يبتلع القطرة. بعد آخر رضعة ، قم بتوفير زجاجات المياه للصراصير. طوال فترة التغذية ، قم بتقييم الحشرات يوميا للتحقق من الوفيات وإزالة أي صراصير لم تعد تتحرك من التجربة.

الإعطاء الفموي المستمر للحواض الدهنية مزدوجة الشريطة قادرا على تقليل تعبير التوبولين في الأمعاء الوسطى من 40٪ في اليوم التاسع إلى 60٪ في اليوم 17. بالمقارنة ، لم يكن للحمض النووي الريبي العاري المزدوج الذي تقطعت به السبل أي تأثير. يرجع ذلك على الأرجح إلى اكتشاف أن تعرض الحمض النووي الريبي العاري مزدوج الشريطة لعصير الأمعاء الوسطى أدى إلى تدهور في غضون ساعة ، في حين ظل الحمض النووي الريبي المزدوج المترافق مع الجسيمات الشحمية مستقرا.

لم تنخفض مستويات الحمض النووي الريبي فحسب ، بل أدت التغذية المستمرة لضجيمات الحمض النووي الريبي مزدوجة الشريطة إلى فتاكة كبيرة. من غير المحتمل أن يكون هذا بسبب الناقل ، حيث أن الدهون التي تحمل الحمض النووي الريبي المزدوج الشريطة إلى EGFP لم تؤد إلى أي فتاك. أثناء محاولة نظام التوصيل الفموي لتداخل الحمض النووي الريبي ، من المهم إجراء تغذية مستمرة للحمض النووي الريبي مزدوج الشريطة لعدة أيام.

بمجرد الإتقان ، يمكن إجراء خطوة التغذية في دقيقتين لكل حشرة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. إذا لزم الأمر ، يمكن تطبيق تركيبات مختلفة من الجسيمات النانوية الشحمية لتحسين إجراءات التغذية وكفاءة الحمض النووي الريبي. في النهاية ، جعلت هذه التقنية من الممكن للباحثين في مجال إدارة الآفات استكشاف استراتيجيات مكافحة جديدة باستخدام الحمض النووي الريبي.