إعداد وضع الأنسجة حاسة الشم الطرفية الجزيئية والتحليل المناعي في المورفولوجية

الهدف العام من التدريج وتشريح الأنسجة الشمية النامية للحدقة والبالغين في ذبابة الفاكهة هو توليد عينات للتحليلات الجزيئية والتنموية للأنسجة الشمية المحيطية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تطوير وتطور الجهاز الشمي مثل ديناميكيات التعبير ومستويات وأنماط جينات معينة في الأنسجة الشمية المحيطية النامية. من خلال هذه الطريقة يمكننا الحصول على نظرة ثاقبة حول تطور نظام حاسة الشم المحيطي في ذبابة الفاكهة الأنواع.

يمكن تطبيقه أيضا على الأنظمة الحسية الأخرى ، مثل الذوق المحيطي والأنظمة البصرية. لتجربة تسلسل الحمض النووي الريبي ، خطط لجمع ما بين 100 إلى 200 قرص هوائي أو هوائي لأربع مراحل مختلفة من التطوير. بالنسبة للكيمياء النسيجية المناعية ، خطط لتشريح 10 إلى 20 ذبابا.

نظف جميع المواد المستخدمة في التشريح باستخدام 70٪ من الإيثانول. بعد ذلك ، قم بتنظيف المواد باستخدام معادلات RNase. وصنع جميع المحاليل باستخدام المياه الخالية من النوكلياز أو المعالجة DEPC.

لجمع الشرانق ، راقب اليرقات على فترات 30 دقيقة. واجمع خادرة في مرحلة APF في ساعة الصفر. ستكون اليرقات غير متحركة ومحاطة بعلبة عذراء فاتحة جدا بيضاء اللون تقريبا.

في هذه المرحلة ، انقل اليرقات إلى طبق بتري صغير بحجم بوصتين مع ورق ترشيح رطب. بالنسبة لتشريح مرحلة APF في ساعة الصفر ، تابع على الفور حصاد قرص الهوائي قبل العذاة. خلاف ذلك ، قم بتغطية الطبق بغشاء البارافين واسمح للحيوانات بالتطور عند 25 درجة مئوية ، حتى تصل إلى مرحلة النمو ذات الاهتمام.

لمرحلة تطور العذراء لأنواع ذبابة الفاكهة الأخرى ، اجمع يرقات ما قبل العذراء وفرزها في قارورة جديدة. ثم سجل عدد الأيام من precepta إلى مرحلة البلوغ. وببساطة قم بالتوسع هذه المرة إلى الجدول الزمني للميلانوجاستر.

للبدء ، قم بتبريد 150 ميكرولتر من محلول عزل الحمض النووي الريبي في أنبوب 1.5 ملم خال من RNase. بعد ذلك ، قم بإيداع عدة قطرات منفصلة من PBS على لوحة التشريح. في كل قطرة من PBS ، ضع خادرة واحدة لتشريحها.

بالنسبة للشرانق التي تتراوح مدتها من صفر إلى ساعتين ، استخدم الملقط للإمساك بخطافات الفم وسحب هذه الهياكل لتمزيق وفضح الأدمغة والأقراص الخيالية. بالنسبة للشرانق التي تبلغ مدتها ثماني ساعات ، قم أولا بتقشير حالة العذراء برفق من الربع الأمامي من الخادرة ، لفضح الرأس النامي. ثم افصل الرأس عند مفصل الرقبة.

أقراص الهوائيات في الرأس في هذه المرحلة من التطور. الآن انقل الأنسجة التي تحتوي على أقراص الهوائيات إلى قطرة أخرى من PBS. بعد ذلك ، حدد قرص هوائي العين المتصل بالدماغ في الفصوص البصرية.

باستخدام ملقط ، افصل قرص هوائي العين وانقله إلى قطرة جديدة. في ثماني ساعات من الشرانق ، تغطى أقراص العين الأقراص الهوائية وكلاهما أمام الدماغ. في القطرة التالية ، قسم العين وأقراص الهوائيات باستخدام الملقط.

ثم باستخدام طرف ماصة P20 ، اجمع الأنسجة المقطوعة برفق بأقل كمية من السائل. قم بإيداع القرص في كاشف محلول عزل الحمض النووي الريبي واستمر في تشريح أقراص الهوائيات حتى يتم جمع 100 على الأقل. بعد 40 ساعة من تكوين الخادرة ، اتخذ الهوائي البالغ شكله النهائي ، لكنه لا يزال شفافا.

هناك حاجة إلى ما لا يقل عن 50 شرانق في هذه المرحلة لجمع تسلسل الحمض النووي الريبي. قم أولا بإعداد 150 ميكرولتر من محلول عزل الحمض النووي الريبي المبرد. على وسادة التشريح ، ضع شرانق في قطرة من PBS.

ثم قم بتثبيت الجسم بزوج واحد من الملقط ، وانزع حالة العذراء برفق من الربع الأمامي لفضح الرأس. ثم قم بإزالة الرأس بعناية عند مفصل الرقبة. الآن انقل الرأس برفق إلى قطرة نظيفة من PBS.

هناك لإزالة الغشاء المحيط بالرأس ، قم بسحب الرأس لأعلى ولأسفل في PBS. مع هذا التنظيف ، يجب أن يصبح الهوائي مرئيا. الآن افصل الهوائي عن الغشاء بين الجزأين الثاني والثالث عند المفصل القطعي.

الجزء الثالث على مستقبلات حاسة الشم الهوائي. ثم استخدم ماصة لنقل الأنسجة المقطوعة برفق إلى محلول عزل الحمض النووي الريبي لتقليل كمية السائل المنقولة. لاستخراج الحمض النووي الريبي، قم بتشريح البالغين أثناء تخديرهم على وسادة CO2.

أولا ، عالج ثاني أكسيد الكربون2 وسادة الملقط بمثبطات RNase. ثم قم بتخدير البالغين وعرض الوسادة تحت مجهر التشريح. باستخدام زوجين من الملقط ، قم بتثبيت الجسم واسحب أو اضغط برفق على جزء الهوائي الثالث من الجزء الثاني من الهوائي الثاني لجمع الأنسجة.

انقل الهوائيات إلى أنبوب من محلول عزل الحمض النووي الريبي عن طريق غمس الملقط في السائل وإطلاقه. يجب غمر الهوائي. إذا الهوائي على الجدار الجانبي ، فسوف يتحلل الحمض النووي الريبي قبل الأوان.

بعد جمع ما يكفي من الهوائيات ، تابع استخراج الحمض النووي الريبي. أو قم بتخزين أنبوب التجميع عند 80 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى. إذا كان الهوائي مخصصا للكيمياء النسيجية المناعية، فقم بإجراء هذا التشريح على وسادة تشريح مع غمر الذبابة في PBS مع Triton أو بدونه.

يمكن استخدام الأنسجة الشمية النامية التي تم تشريحها لاستخراج الحمض النووي الريبي متبوعا ب RT-PCR لتقييم التعبير الجيني. على سبيل المثال ، يمكن دراسة التعبير عن نصوص المستقبلات السطحية ونصوص المستقبلات الشمية بهذه الطريقة. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام الأنسجة للكيمياء المناعية لتحديد نمط التعبير والتوطين الخلوي للجينات ذات الأهمية.

على سبيل المثال ، يمكن تلطيخ الذباب المعدل وراثيا Rn-EGFP بالأجسام المضادة المضادة ل GFP والمضادة لللامينين. يظهر التحليل أنه بعد 40 ساعة من تكوين الخادرة ، يكون جين Or67d نشطا في خلايا معينة في الهوائي ، مما يؤدي إلى التعبير عن GFP تحت نظام GAL4-UAS. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء التشريح في ساعة واحدة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على الوقت والانتقاء والشيخوخة والتشريح المجدول بشكل مناسب ، بناء على الإطار الزمني لتطور العذراء لكل نوع ذبابة الفاكهة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل qRT-PCR ، والكيمياء المناعية ، بالإضافة إلى تقنيات التلوين في الجسم الحي والتنميط النسخي الأخرى من أجل الإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بنمط وملامح النسخ على مستوى الأنظمة داخل الأنسجة النامية. بعد تطويرها ، ستمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تطور وتطوير الأنظمة الحسية لاستكشاف ديناميكيات النسخ واكتشاف الجينات الجديدة في الأنظمة الحسية الأخرى في أنواع ذبابة الفاكهة.

لا تنس أن العمل باستخدام ملقط حاد وبعض محاليل استخراج الحمض النووي الريبي والفورمالديهايد يمكن أن يكون خطيرا للغاية. يجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل الممارسة السابقة مع التشريح ، لتطوير المهارات الحركية الدقيقة ، والانتباه العالي وارتداء ملابس المختبر المناسبة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.