تعديل التوليف ووصف 1، 2-ديثيولاني الببتيدات تجميع ذاتي

مع نمو الهياكل لزيادة وظائف الهياكل الجزيئية الفائقة ، يمكن أن تساعد هذه الطريقة المتمثلة في دمج مجموعات 1 ، 2-dithiolane مع الببتيدات ذاتية التجميع في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول التفاعل على الأسطح الجزيئية الفائقة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن اقتران وإزالة الحماية من جزيء السلائف 1 ، 2-dithiolane يحدث على الراتنج مع خطوة تنقية واحدة فقط من الببتيد المعدل النهائي. نظرا لاختلاف الوقت الذي تستغرقه التجميعات لتنضج في هياكلها الجزيئية الفائقة النهائية ، فإن العرض المرئي لطرق التوصيف ونتائج التجميعات الجزيئية الفائقة أمر بالغ الأهمية.

لتصنيع سلائف ثنائي الثيولان ، قم أولا بإذابة جرام واحد من حمض 3-برومو-2-بروبريونيك في حوالي أربعة ملليلتر من هيدروكسيد الصوديوم أحادي المولار في قارورة تفاعل مستديرة القاع سعة 50 مليلتر عند 55 درجة مئوية مع التحريك. عندما يتم تعليق الكاشف بالكامل في المحلول ، أغلق قارورة التفاعل بحاجز وضع القارورة تحت جو النيتروجين. بعد ذلك ، أضف 1.49 جرام من ثيواستات البوتاسيوم وثلاثة ملليلتر من حمض الكبريتيك ثنائي المولار إلى أربعة ملليلتر من الماء منزوع الأيونات لإنتاج حمض ثيوأسيتيك في الموقع.

استنشق محلول حمض الثيوأسيتيك في حقنة بلاستيكية سعة 10 ملليلتر يمكن التخلص منها وقم بتجهيز المحقنة بإبرة قياس 18 ، ثم اخترق الحاجز بالإبرة لإضافة الخليط بالتنقيط إلى قارورة التفاعل واستمر في التفاعل طوال الليل عند 55 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي ، راقب التفاعل عن طريق كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة على ألواح هلام السيليكا 60 F254 باستخدام مزيج من الميثانول وثنائي كلورو الميثان وتصور تقدم التفاعل بواسطة بقعة البروموكريسول الخضراء. عندما يبرد التفاعل المكتمل إلى درجة حرارة الغرفة ، قم بتحمض الخليط بحمض الكبريتيك ثنائي المولار إلى درجة حموضة واحدة.

يجب فصل الزيت الأصفر عن المحلول ، ثم استخراج المنتج بثلاث إضافات سعة 40 مليلتر من الكلوروفورم البارد ودمج الطبقات العضوية للتجفيف فوق كبريتات المغنيسيوم ، وإزالة الكلوروفورم تحت ضغط منخفض. يجب أن يكون المنتج زيتا أصفر بعائد إجمالي 83٪ ويمكن استخدامه دون مزيد من التنقية. لإقران سلائف ثنائي ثيولان بالطرف N للببتيد الموجود على الراتنج ، أضف أربعة مكافئات من سلائف ثنائي الثيولان إلى خمسة ملليلتر من ثنائي ميثيل فورماميد ، وأربعة مكافئات من HBTU ، و 10 مكافئات من DIPEA.

اترك خليط التوصيل ينشط مسبقا لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل إضافة العينة إلى المحقنة المحتوية على راتنج N-terminus. رج تفاعل الاقتران لمدة ساعتين ، متبوعا بثلاث غسلات سعة خمسة ملليلتر في ثنائي ميثيل فورماميد طازج وكرر تفاعل الاقتران والرج طوال الليل. بعد الاقتران الثاني ، اغسل الراتنج بثلاث غسالات ثنائي ميثيل فورماميد سعة خمسة ملليلتر متبوعة بثلاث غسالات من راتنج ثنائي كلورو ميثان سعة خمسة ملليلتر وانقل الراتنج المجفف إلى أنبوب تفاعل ميكروويف سعة 10 ملليلتر.

بعد ذلك ، لإزالة حماية مجموعة ثيوأسيتات من سلائف ثنائي ثيولان N-terminal ، أضف ملليلترين من ثنائي ميثيل فورماميد إلى الأنبوب. اسمح للراتنج بالانتفاخ ، وأضف قضيب تحريك مغناطيسي صغير إلى الوعاء ، وأعد تعليق الراتنج مع التحريك المغناطيسي منخفض السرعة. بعد 15 دقيقة ، أضف ملليلترين من هيدروكسيد الأمونيوم المركز إلى الأنبوب ، وقم بتغطية وعاء التفاعل بحاجز سيليكون ، وضع الوعاء في مفاعل الميكروويف لمدة 45 دقيقة عند 75 درجة مئوية مع التحريك.

عند اكتمال تفاعل الميكروويف ، انقل الراتنج إلى حقنة نظيفة يمكن التخلص منها ومقبرة واغسل الراتنج بغسلتين من ثنائي ميثيل فورماميد سعة خمسة ملليلتر وغسلتين من الميثانول سعة خمسة ملليلتر. بعد الغسيل الأخير ، أضف خمسة ملليلتر من كوكتيل الانقسام إلى المحقنة المحتوية على الراتنج لمدة 1 1/2 ساعة مع رج لطيف في درجة حرارة الغرفة. لتحضير مليلتر واحد من الببتيد الخام للكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء أو تنقية HPLC ، أضف 400 ميكرولتر من مخزون الببتيد المركز في الأسيتونيتريل إلى 600 ميكرولتر من الماء المكمل بنسبة 0.1٪ من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك وقم بتصفية المحلول من خلال مرشح حقنة 22 ميكرومتر في قارورة HPLC.

لتنقية الببتيد ، استخدم عمودا شبه تحضيري C18 بمعدل تدفق ثلاثة ملليلتر في الدقيقة على تدرج خطي من 15 إلى 55٪ أسيتونيتريل في 20 دقيقة مع ضبط كاشفات الأشعة فوق البنفسجية على 222 نانومتر و 330 نانومتر. ثم اجمع وجمع قمم الاهتمام. لتأكيد منتج الببتيد عن طريق وقت الامتصاص / التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة أو قياس الطيف الكتلي MALDI-TOF ، امزج 0.5 ميكرولتر من الذروة المجمعة على لوحة امتصاص / تأين بالليزر بمساعدة المصفوفة تحتوي على 0.5 ميكرولتر من مصفوفة حمض 2 ، 5-ثنائي هيدروكسي بنزويك.

لتحضير محلول ذاتي التجميع ، قم بإذابة ملليغرام واحد من مسحوق الببتيد المجفف بالتجميد في خليط من 20٪ أسيتونيتريل و 10 ملليمولار HEPES في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر ، ثم قم بتدوير محلول التجميع واترك العينة لتتجمع في درجة حرارة الغرفة. عندما تصل مجموعة الببتيد إلى مرحلة النضج ، جفف ثمانية إلى 10 ميكرولترات من محلول التجميع كغشاء رقيق على بلورة الماس ذات الانعكاس الكلي المخفف وراقب اختفاء ذروة مياه كبيرة وواسعة من 1640 إلى 1631 سنتيمترا عكسيا كما يتشكل الفيلم الجاف. احصل على أطياف الخلفية والأشعة تحت الحمراء من 1500 إلى 1800 سنتيمتر عكسي بمتوسط 50 عملية مسح بدقة سنتيمترين عكسية ، مع طرح عمليات المسح الضوئي في الخلفية قبل كل مسح عينة.

يجب ملاحظة توقيع الأشعة تحت الحمراء لتجميع صفائح بيتا كذروة حادة بين 1625 و 1635 سنتيمترا عكوسية. عندما تنضج عينات الببتيد إلى هياكل جزيئية فائقة غنية بألواح بيتا ، قم بتحميل 10 ميكرولترات من محلول تجميع الببتيد على سطح شبكة الكربون المجهرية الإلكترونية للإرسال والسماح للتجميعات بالامتصاص على سطح الشبكة لمدة دقيقة إلى دقيقتين. المس ورق الترشيح على حافة الشبكة لإزالة العينة الزائدة ، وأضف 10 ميكرولترات من صبغة أسيتات اليورانيل المحضرة حديثا بنسبة 2٪ إلى سطح الشبكة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق ، ثم قم بإزالة البقعة الزائدة بورق الترشيح وضع الشبكة في مجفف مفرغ طوال الليل قبل التصوير في اليوم التالي بواسطة المجهر الإلكتروني للإرسال.

بصرف النظر عن التوليف الأولي المكون من خطوة واحدة لجزيء سلائف ثنائي الثيولان ، يحدث باقي تخليق الببتيد المعدل 1 ، 2-ثنائي ثيولان على دعم صلب. يتم تأكيد تحويل حمض 3-برومو-2-بروبريونيك إلى حمض 3-2-بروبانويك ، سلائف ثنائي الثيولان ، بواسطة البروتون والرنين المغناطيسي النووي الكربون-13 قبل أن يقترن بأمين N-terminus الحر لببتيد لا يزال على الراتنج. بعد إزالة الحماية ، يتم تنقية الببتيد الخام بواسطة HPLC في المرحلة العكسية ويتم تأكيد كتلة المنتج بواسطة قياس الطيف الكتلي MALDI-TOP.

يمكن استخدام التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء وثنائي اللون الدائري لتحويل فورييه لمراقبة التجميع الذاتي لببتيد 1 ، 2-dithiolane المنقى إلى ألياف أميلويد ناضجة لتوصيف تشكلها الممتد لصفائح بيتا. يمكن بعد ذلك تصوير الألياف عن طريق المجهر الإلكتروني للإرسال. بينما يمكن استخدام هذه الطرق لتعديل الطرف N لأي تسلسل ببتيد لا يزال على الراتنج ، فمن المهم أن تتذكر أنه يجب تحسين ظروف التجميع الذاتي للببتيد لكل ببتيد.

ستسمح هذه التقنيات ، التي تضيف مجموعات 1 ، 2-dithiolane إلى الببتيدات ذاتية التجميع ، للباحثين في مجال المواد الحيوية باستكشاف تفاعل السطح الجزيئي الفائق.