طريقة سيفينج فعالة لعزل Glomeruli سليمة من الفئران الكبار الكلي

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أمراض الكلى. خاصة في فهم الكبيبات في الدول العادية والمُرَضَة. يمكن أن يكون من الصعب دراسة الأحياء الكبزية بسبب تنوع أنواع الخلايا الموجودة وبنيتها الفريدة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو توفير مصدر متاح بسهولة من الكبيبات السليمة باستخدام أساليب بسيطة والمعدات. هذه التقنية لها آثار على فهمنا لحاجز الترشيح في الكلى العادية والمُرَضَة. على وجه الخصوص، فإنه يمكن أن يلقي الضوء على فهمنا لمرض الكلى المزمن proteinuric الذي إصابة الكبيات يؤدي إلى إفراز عالية بشكل غير طبيعي من بروتينات المصل في البول.

عموما، سوف يكون الأفراد الجدد لهذه التقنية صعوبة في الحصول على العائد الكافي والنقاء في العينة النهائية. إثبات الإجراء سيكون بريتني راش، فني من مختبري. للبدء ، استخدم مقصات الشعر لإزالة الشعر من البطن الأمامي للجرذ الرحيم.

استخدام 70٪ الإيثانول لتنظيف الجلد المكشوفة. ثم، باستخدام مقص الجراحية، وجعل شق في منتصف الطريق في الجلد. لفضح الأعضاء الداخلية، قم بعمل شق في منتصف الطريق عبر طبقة العضلات.

تحديد موقع وعزل الكلى ووضعها في أنبوب مخروطي بلاستيكي معقمة 50 ملليلتر مع 30 ملليلتر من محلول الملح الاحتياطي الخاص بـ Hank أو HBSS الموضوع على الجليد. نقل أنبوب على الجليد إلى خلية عقيمة هود ثقافة. نقل الكلى إلى طبق بيتري معقمة تحتوي على خمسة ملليلترات من HBSS وضعت على الجليد.

استخدام مقص والملقط حادة لإزالة والتخلص من الدهون perirenal. لإزالة الكبسولات المحيطة بالكلية والتخلص منها، قم بعمل شق سطحي صغير ثم استخدم ملقطًا حادًا لسحبها بلطف بعيدًا عن الكلى. ضع الكلى على شاش معقمة في طبق بيتري ثانٍ مع خمسة ملليلترات من HBSS واقسم كل كلية إلى نصفين من خلال قسم منتصف القوس.

استخدام مشرط لإزالة وتجاهل النخاع الذي يمكن التعرف عليه من خلال لونه أغمق وموقع مركزي. نقل القطع المتبقية التي تحتوي في الغالب قشرة الكلى، إلى طبق بيتري الثالث مع خمسة ملليلتر من HBSS. استخدم شفرة حلاقة معقمة لفرمها حتى يقل حجم القطع عن ملليمتر واحد أو حتى تتشكل عجينة.

استخدام 1٪ BSA برنامج تلفزيوني لتبلل الجزء العلوي والسفلي من غربال ميكرومتر 180 على 500 ملليمتر من النفايات منقار. هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية لأنها المعاطف الغربال مع البروتين ويقلل من الالتزام من glomeruli التي سوف ثم تحسين العائد. ضع القشرة المختلطة على حافة صغيرة من الغربال.

استخدام شفة المكبس محكم من حقنة 10 ملليلتر المتاح لدودة الأنسجة من خلال منخل في مقلاة أسفل وضعت على الجليد. شطف دوريا مع HBSS باستخدام أقل قدر ممكن لتجنب تخفيف العينة وإعادة استخدام السوائل جمع في المقلاة السفلية لشطف المنخل. بعد الانتهاء من الغربل، وغسل بعناية الجزء السفلي من الغربال مع HBSS من الجزء السفلي من المقلاة لالتقاط أي glomeruli التمسك فضفاضة.

تقسيم كل من السائل من المقلاة السفلية إلى 10 ملليمتر الحقن مجهزة 20 الإبر قياس. مرر السائل عبر الإبرة ثلاث مرات على الأقل في المقلاة السفلية. لجمع الماضي، والحفاظ على الكبيبات التي تحتوي على السوائل في حقنة حتى جاهزة لتمريره من خلال منخل ميكرومتر 90.

وفي الوقت نفسه، غسل عمومة أسفل عن طريق مسح ذلك مع 1٪ BSA برنامج تلفزيوني وإلى منقار النفايات. استخدام 1٪ BSA برنامج تلفزيوني لتبلل الجزء العلوي والسفلي من غربال 90 ميكرومتر ومن ثم وضعه على الجزء العلوي من عموم أسفل. تطبيق العينة في الحقن على حافة واحدة من الغربال.

استخدام شفة المكبس محكم لتهريس الأنسجة من خلال منخل كما فعلت سابقا. استخدم المحلل من المقلاة السفلية لغسل الأنسجة وجمع كل شيء من حافة واحدة من الغربال. بمجرد اكتمال التفاح ، قم بغسل قاع المنخل بعناية مع عازلة HBSS من أسفل المقلاة لالتقاط أي glomeruli التي قد يتم الالتزام بها بشكل فضفاض.

جمع كل السوائل من المقلاة السفلية في أنبوب مخروطي بلاستيكي 50 ملليلتر. استخدام 1٪ BSA برنامج تلفزيوني لغسل المقلاة السفلية في منقار النفايات. ثم استخدام 1٪ BSA برنامج تلفزيوني لتبلل الجزء العلوي والسفلي من غربال ميكرومتر 75.

ضع المنخل على قمة المقلاة السفلية الموضوعة على الجليد. تطبيق العينة على حافة واحدة من الغربال مع السائل المتدفقة من خلال بسهولة. شطف الجزء العلوي من غربال مع ما لا يقل عن 20 ملليلتر من 1٪ BSA برنامج تلفزيوني في منبر النفايات وغسل بعناية الجزء السفلي من المنخل.

لجمع الكبيات التي بقيت على الجزء العلوي من منخل 75 ميكرومتر، شطف من خلال المنخل رأسا على عقب مع أكبر قدر HBSS حسب الحاجة لجمع كبيباتولي في طبق بيتري. جمع الكبيبات منخل في أنبوب مخروطي البلاستيك 50 ملليلتر على الجليد. بعد الطرد المركزي في 1800 مرة G لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية، وإزالة فائقة بعناية باستخدام ماصة.

إعادة تعليق بيليه في 10 ملليلتر من HBSS الباردة. الجمع بين العينات وتكرار الطرد المركزي. إعادة تعليق الكبيميرولي في خمسة ملليلتر من HBSS.

لحساب الكليات الكبيبات، ضع قطرة 10 ميكرولتر من العينة على شريحة زجاجية، عد تحت المجهر ومتعددة من قبل 500 للحصول على إجمالي العائد. وينبغي أن تتكون هياكل معزولة من كل glomeruli تقريبا دون هياكل أنبوبي. إذا كانت الأنابيب موجودة وتؤثر على تطبيق المصب الخاص بك، يمكن إزالتها عن طريق تطبيق العينة بأكملها على منخل 90 ميكرومتر وتكرار البروتوكول من تلك النقطة فصاعدا.

البروتوكول الموصوف هنا فعال في عزل الكبيباتولي والتعليق النهائي هو مكتظة مع كبيبات مع نقاء أكبر من 95٪، والحد الأدنى من التلوث من شرائح أنبوبي أو أنواع الخلايا الأخرى. يمكن أن تكون ملطخة هذه الجلجوميري مع البقع الهيماتوكسيلين ويوسين لعرض مورفولوجيا بهم. وعلاوة على ذلك، فإنها تحافظ على هيكلها في جميع أنحاء البروتوكول بأكمله حتى بعد المعالجة.

أنها تحتفظ podocytes سليمة وقابلة للحياة، والخلايا mesangial والخلايا البطانية. وقد تعرضت الكبيبولي المعزولة لإصابات كيميائية لمحاكاة في علم الأمراض الحية. على وجه التحديد كبريتات البروتامين الذي يعطل تهمة حاجز الترشيح الكبيبي.

على عكس الكبيبيولية الصحية ، تم علاج كبريتات البروتينات في الكبيبات ، ويكون انخفاضًا بارزًا في النيفرون وعددًا من النوى إيجابية لـ WT1. عندما ينظر إليها مع المجهر الإلكترون انتقال, الكبيبات صحية تظهر عمليات القدم نموذجية. بعد علاج كبريتات البروتامين ، يتم ممدود أو مسح عمليات القدم مما يدل على إصابة podocyte.

لتحديد صلاحية الخلية في كبيباتولي المعزولة ، لوحظ أن ثلاثة كاسباس مشقوق كعلامة موت الخلايا المبرمج. لم يكن هناك كاسباس مشقوق ثلاثة في صفر وساعة واحدة بعد عزل كبيبيريولي. أظهرت بعض الخلايا علامات موت الخلايا المبرمج في ساعتين وأربع ساعات مع زيادة تدريجية مع مرور الوقت.

ولوحظ أن أكبر عدد من الخلايا المبرمجة في 24 و 48 ساعة. وبناء على هذه النتائج، نوصي بأن يتم استخدام الكبيبات المعزولة مباشرة بعد العزلة لمعظم التجارب. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم أن تعمل بسرعة وكفاءة.

من لحظة عزل الكلى ، تبدأ الكبيبات في التدهور. أسرع عزل الكبيات، والمزيد من الوقت سيكون لديك لتشكل، والعزلة، والتلاعب. بعد العزل ، يمكن أن تتعرض الكبيبات المعزولة إلى عوامل كيميائية أو بيولوجية لتحفيز الحالات الفسيولوجية أو المرضية.

ويمكن أن تكون العينات عملية لعزل البروتين أو الحمض النووي الريبي، الأنسجة أو المناعة والمجهر الإلكتروني. منذ تطورها في 1950s، وقد ساعدت هذه التقنية الباحثين في دراسة علم الأحياء الكبيئي. عموما، يوفر هذا البروتوكول طريقة لتقييم الخصائص المورفولوجية والخلوية من الكبيباتولي سليمة في الدول العادية والمُرَضَة.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة فهمنا لمرض الكلى المزمن proteinuric والمساعدة في تطوير العلاجات المستقبلية.