زرع الذرية القشرية الهندسية كيميائياً في عقول الفئران المبكرة بعد الولادة

مع هذا الأسلوب، يمكننا دراسة آثار النشاط الجوهري على نضوج السلائف التورين القشرية. توفر هذه التقنية طريقة فعالة لاستهداف ومعالجة الخصائص الخلوية لذروة الزّورية القشرية التي يمكن الوصول إليها لغالبية المجتمع العلمي. هذا البروتوكول ينطوي على التعامل الدقيق مع العينات والمعدات ، ويمكن أن يكون أفضل تقدير من خلال العرض التوضيحي البصري.

باستخدام قلم مقاوم للماء، ارسم خطًا مستقيمًا عبر منتصف الجزء السفلي من السطح السفلي لستة أطباق بيتري من عيار 35 ملليمترًا. إضافة 10 ملليلتر من السائل 4٪ منخفضة gelling agarose في PBS في اثنين من أطباق بيتري 35 ملليمتر وتضمين ثلاثة إلى أربعة العقول تشريح في agarose مع المصابيح الشمية التي تواجه أسفل في كل طبق عبر الخط المستقيم، وترك ثلاثة إلى خمسة ملليمترات من الفضاء بين كل عينة. عندما تم تضمين جميع العقول ، ضع الأطباق عند أربع درجات مئوية للسماح للـ agarose بتوطين ونحت الأدمغة الثلاثة في كتلة واحدة من agarose ، تاركًا ما يقرب من ثلاثة ملليمترات من الجل حول حواف العينات.

الغراء كتلة على سطح قاعدة microtome واستخدام شفرة الجراحية لقطع كل وسيلة من خلال الجزء السفلي من كتلة بين كل عينة الأنسجة للحصول على ثلاث كتل مستقلة. بعد ذلك ، استخدم ميكروتوم شفرة تهتز لقسم الكتل في حل كريبس الباردة الجليد في شرائح سميكة 250 ميكرومتر ، وذلك باستخدام microspatula مسطحة عازمة لجمع فقط الشرائح التي تحتوي على سمينات العصابات المتوسطة أو caudal ganglionic. ثم، ضع كل قسم على الفردية 13 ميكرومتر القطر، ثمانية ميكرومتر المسام حجم أغشية مرشح عائمة على الحد الأدنى من المتوسطة الأساسية في مركز البوليسترين الفردية أطباق ثقافة الجهاز جيدا.

عندما يتم الحصول على جميع الأقسام ، ضع الأطباق في حاضنة استزراع أنسجة ثاني أكسيد الكربون عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. قبل حقن الحمض النووي البؤري، ضع قطرها ملليمتر واحد، أعمدة أغاروز طويلة من 10 ملليمترات لكماتة بزجاج بطول 225 ملليمترًا، ماصة زجاجية سعة مليلتر في محلول كريبس بارد. باستخدام شفرة جراحية، وقطع قطعة واحدة أصغر من agarose لتناسب على سطح القطب الكهربائي وقطعة واحدة أكبر لاستخدامها كقاعدة لحقن الحمض النووي البؤري.

ثم، ضع كتل agarose في حل كريبس الجليد الباردة. للحقن، اخلطي التعبير وتحكمي في الحمض النووي المتجه في ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر تركيز لكل متجه، ثم أضف محلول الأسهم الخضراء السريع في تخفيف واحد إلى 10. ملء القطر الداخلي سحب 0.5 ملليمتر، واحد ملليلتر الخارجية الزجاج ميكروبيت مع 10 ميكرولترات من خليط الحمض النووي وتحميل micropipette في حاقن بيكومم هوائي.

ضع كتلة أكبر من agarose تحت مجهر ستيريو ووضع شريحة ليتم حقنها على قطعة من agarose. ثم، حقن 25 إلى 50 نانولتر وحدات التخزين في منطقة وسمو العقدة الوسيطة أو العقدية السدية المحدد من شريحة. مباشرة بعد الحقن، ضع كتلة agarose الصغيرة على القطب طبق بيتري واستخدام ميكروبساتولا مسطحة انتهت لإرفاق عمود agarose إلى القطب غطاء المحمول.

نقل شريحة حقن مع الغشاء الداعم لها على كتلة agarose ووضع القطب العلوي مع عمود agarose على رأس المنطقة المختارة من الشريحة. ثم، الكهربائي المنطقة مع اثنين من نبضات خمسة مللي ثانية من 125 فولت، 500 مللي ثانية بعيدا. بعد electroporation، وضع شريحة مع الغشاء الداعم لها مرة أخرى في طبق عقد لها والعودة الطبق إلى حاضنة ثقافة الأنسجة.

بعد ساعة واحدة، استبدل الحد الأدنى من الوسيلة الأساسية مع وسيلة أساسية مناسبة لثقافات الخلايا العصبية الأولية وإعادة شرائح إلى الحاضنة بين عشية وضحاها. في هذه التجارب الكهربائية، ما يقرب من 50٪ من الخلايا العصبية الإيجابية GFP شارك في التعبير عن البروتين حقن إيجابية RFP وبالتالي، فإن السكان السلبية RFP إيجابية GFP بمثابة مراقبة داخلية لتأثير أربطة الحمض النووي حقن. كما أنّ إدارة الأكسيدات الكلوزابين تزيد بشكل انتقائيّ من نشاط الخلايا الإيجابية لفيروس إعادة الإرسال عبر الوطنية، كما يظهر ذلك التعبير عن البروتين المعتمد على النشاط، c-Fos، في أقسام الأنسجة الإكللية الوليدة هذه.

كما يؤدي علاج كلوزابين والأكسيد إلى زيادة نسبة الخلايا الإيجابية في برنامج إعادة تقديم العروض ذات الصلة بالنسبة لعدد الخلايا السلبية لفيروس إعادة تقديم العروض الإيجابية من نوع GFP مقارنة بزمل النفايات التي تُدار في السيارة. يمكن استخدام هذا الإجراء لدراسة آثار التورون المطعمة المُعَدَّد بالنشاط على لدونة الدورة الدموية ووظيفة الدماغ للمضيف.