تصور التفاعلات الأمعاء Microbiota المضيف عبر الفلورسينس في التهجين الموقع ، تلطيخ ليكتين، والتصوير

يفصل هذا البروتوكول المبسط سير العمل للكشف عن البكتيريا في عينات الأنسجة المعقدة وصورها ، من إصلاح الأنسجة إلى تلطيخ الميكروبات بالفلورسنت في التهجين الموقعي .

الميكروبات التي تستضيف المرتبطة تشكل هذا النظام الإيكولوجي المعقد جدا التي تتطلب حقا التصوير أن يفهم. ومن خلال هذا الجسيم، سنعرض لك كيفية المرور بعملية التلطيخ وتحقيق التصور لواجهة الميكروبيوم المضيفة. يتطلب فهم بيولوجيا البكتيريا المرتبطة بالمضيف فهما لتوطينها داخل البيئات الدقيقة.

وهذه التقنية ستمكننا من تصور التا المتكاملة الفردية داخل البيئات المضيفة، وكذلك في سياق البكتيريا الأخرى. من خلال هذه التقنية ، سيكون من الممكن تحديد البكتيريا التي قد تكون اخترقت الأنسجة المضيفة ، وكذلك تحديد ما إذا كانت الميزات الرئيسية مثل المخاط المضيف قد تكون مستنفدة. إعداد الميثاكارن الطازج في حاوية متوافقة مع الميثانول المطلق 60٪، 30٪ الكلوروفورم و 10٪ حمض الخليك الجليدي.

باستخدام أدوات حادة ونظيفة، وقطع شرائح الأمعاء من الفئران للتصوير. تقليل إزعاج العينة قدر الإمكان والتعامل مع المقاطع من التلال لتجنب التأثير على منطقة التصوير. إصلاح العينة في أقرب وقت ممكن بعد تشريح لمنع تدهور.

ضع أقسام الأمعاء في أشرطة الأنسجة عن طريق عقد بدقة حافة الأنسجة مع ملاقط. أغلق الكاسيت واغمره بالكامل في محلول الميثاكارن الطازج ، مما يضمن أن الحل ليس أقدم من بضع ساعات عند غمر الكاسيت. بالنسبة للعينات السريرية التي سيتم جمعها في جناح سريري دون الوصول إلى غطاء الدخان ، استخدم حاوية تخزين البولي إيثيلين مع قطع رفرف في الغطاء الذي سيسمح بمرور أشرطة الأنسجة.

الشريط هذا رفرف اغلاق عند عدم تمرير العينات لمنع هروب الأبخرة السامة. وضع البارافين في وعاء مقاوم للحرارة وتذوب في الفرن في 60 درجة مئوية بين عشية وضحاها. اغسل الأنسجة عن طريق سكب السائل في وعاء النفايات المناسب واحتضانه بالتسلسل في الميثانول المطلق والإيثانول المطلق والزيلين كما هو موضح في مخطوطة النص.

فتح أشرطة قليلا للسماح للبارافين للدخول دون فقدان شرائح الأنسجة باستخدام قفازات مزدوجة أو ملاقط. غمر وإغلاق أشرطة في حاوية من البارافين الذائب. ضع الحاوية مرة أخرى في فرن 60 درجة مئوية ، مما يضمن أن الكاسيت مليء بالبارافين ولا تبقى فقاعات هواء كبيرة.

بعد الحضانة لمدة ساعتين، قم بإزالة الحاوية من الفرن. باستخدام ملقط، وإزالة بعناية أشرطة الفيديو. سخني الفرن إلى 60 درجة مئوية وقبل الحرب جرة كوبلين.

إضافة ما يكفي من حجم الزيلين في زجاجة لتغطية الشرائح الزجاجية في جرة مرتين ووضع parafilm حول الغطاء لمنع تبخر xylenes. السماح لدرجة حرارة xylenes لتصل إلى 60 درجة مئوية. إعداد حل التهجين FISH كما هو مذكور في المخطوطة النصية.

ضع الشرائح في جرة كوبلين ، مع التأكد من أن المقاطع لم تكن على اتصال مع الشرائح الأخرى أو الجرة وخبز الشرائح عند 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. في غطاء الدخان، وملء جرة كوبلين مع xylenes prewarmed من الفرن، مع الحرص على عدم صب مباشرة على رأس العينات ويحتمل أن طرد الأنسجة. ضع جرة كوبلين مرة أخرى في الفرن 60 درجة.

صب xylenes المستخدمة في حاوية النفايات المناسبة، مع الحرص على عدم إزعاج أقسام الأنسجة على الشرائح الزجاجية واستخدام زوج من ملقط للحفاظ على الشرائح من السقوط من جرة كوبلين. تجديد جرة كوبلين مع xylenes المتبقية واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في غطاء محرك السيارة الدخان. احتضان الأقسام في 99.5٪ الإيثانول لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد الحضانة، قم بإزالة الشرائح من جرة كوبلين. مسح الجزء الخلفي من الشرائح على مسح المختبر أو منشفة ورقية ولفترة وجيزة الهواء الجاف حتى قطرات الإيثانول ولت. إنشاء دوائر قريبة جدا حول كل قسم الأنسجة باستخدام مانع السائل أو قلم PAP للحد من مساحة التوسع اللازمة لتغطيتها من قبل الحل التهجين، وتجنب الاتصال الحبر مع القسم.

إعداد حل التهجين وإضافة 0.5 ميكروغرام من المسبار لكل 50 ميكرولتر من الحل المستخدم. Pipette الحل على المقاطع على الشريحة. تراكب القسم مع الأغطية البلاستيكية مرنة، وضمان أن حجم السائل المستخدم يغطي القسم بأكمله.

إنشاء غرفة رطبة مع مربع تلميح ماصة مع مناديل أو المناشف الورقية التي تم غارقة مع محلول التهجين الزائد أو برنامج تلفزيوني لتوفير الرطوبة. احتضان الشريحة في غرفة رطبة في 45 إلى 50 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات على الأقل اعتمادا على تعيين التحقيق للحد من التبخر. إزالة الأغطية البلاستيكية واحتضان الشرائح في الأسماك العازلة الغسيل في جرة كوبلين على حد سواء prewarmed إلى 50 درجة مئوية.

ضعي جرة كوبلين مرة أخرى في فرن 50 درجة مئوية لمدة 10 إلى 20 دقيقة. إزالة المخزن المؤقت غسل FISH واستبداله برنامج تلفزيوني في جرة كوبلين. مباشرة بعد إعادة ملء جرة كوبلين مع برنامج تلفزيوني ، decant برنامج تلفزيوني.

إزالة الشرائح من جرة وماصة كونترستانت على رأس القسم بأكمله، مع التأكد من عدم لمس الأنسجة مع طرف ماصة. احتضان في أربع درجات مئوية لمدة 45 دقيقة. غسل البقع ثلاث مرات بسرعة مع برنامج تلفزيوني جديد.

مسح الجزء الخلفي من الشرائح ضد مسح أو منشفة ورقية والسماح لمعظم برنامج تلفزيوني تتبخر قبالة المقاطع بمساعدة خط فراغ متصلة تلميح ماصة. قم بتحميل المقاطع باستخدام وسيطة تركيب. ألصق الأغطية على الشريحة عن طريق الرسم على طول حواف الغطاء مع طلاء الأظافر الواضح ، مع الحرص على الابتعاد عن حافة الشريحة.

دعه يحدد في درجة حرارة الغرفة. وتظهر هنا صور القولون البعيدة من الماوس أحادية المستعمر مع الأمعاء Muribaculum واحد ثنائي المستعمر مع الأمعاء Muribaculum وBacteroides thetaiotaomicron. وكانت العينات ملطخة مسبار FISH ثلاثة الرئيسية السيانين-3 الموسومة محددة لعزل Muribaculum وأيضا مضادة مع الليكتين الليكتين ملزمة رودامين UEA-1 وDAPI.

تظهر صور المقاطع الملطخة بقنوات Cyanine-3 FISH و DAPI وCyanine-3 FISH وDAPI مجتمعة توطين الأمعاء Muribaculum. جميع إشارات DAPI على شكل بكتيريا وحجم البكتيريا تحمل اسم السيانين-3 في حالة الاستعمار الأحادي. في حالة الاستعمار الثنائي ، بالإضافة إلى هذه الخلايا الإيجابية المزدوجة Cyanine-3 و DAPI ، هناك خلايا بكتيرية ملطخة ب DAPI سلبية سيانين-3 كما هو متوقع.

باستثناء البكتيريا الخيطية الأطول ، فإن الهياكل الإيجابية الأكبر لل DAPI هي مواد نباتية أو نواة من الخلايا المضيفة. مقطع معوي تم تقسيمه على عمق يوفر رؤية لللمن بالإضافة إلى مناظر طولية للظهارة وجزء مقطع ضحل يكشف فقط عن مقاطع عرضية من سرداب ولا توجد طبقة مخاطية ثابتة أو بكتيريا تثبت أن التقسيم الضحل لن يوفر شرائح مضيئة من الأمعاء. تؤدي تغطية الأنسجة أو الأغطية غير المستوية إلى مسح بلاط ضبابي ومضاء بشكل غير متساو.

كما يظهر هنا مثال على الخلفية العادية والخلفية العالية. كما نتعلم المزيد عن الكائنات الحية المجهرية، أصبح من الواضح حقا أن المقايسات السائبة مثل التسلسل ليست كافية لتحديد حقا ما يحدث بين الأنواع الميكروبية المختلفة وكيفية تفاعلها معا. ولهذا، نحن حقا بحاجة للتصوير.

وقد سمح هذا النوع من التقنية ببعض الاكتشافات الهامة حقا، على سبيل المثال، أن الحرمان من الألياف من النظام الغذائي يسبب ترقق طبقة المخاط والعدوى المحتملة من قبل مسببات الأمراض مثل دراسات من مجموعة مارتينز، فضلا عن دراسات في آثار الإسهال التناضح وكيف أن استنفاد طبقة المخاط يؤثر حقا على كل من المضيف والميكروبيوتا. وكانت هذه الدراسات التي أجرتها مجموعة سوننبرغ، فضلا عن مجموعتنا.