التصور الحجمية في الشجاعة القراد بالجامعة-جبل في الموقع التهجين

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول علم حشرات القراد ، مثل تقييم وجود بكتيريا قابلة للحياة في القراد مكانيا وزمانيا. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها لا تتطلب تقسيم القراد أو المعدات باهظة الثمن ، وأنها تسمح بالتصور المكاني والزماني لنصوص الجينات. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه التقنية لأنها تتضمن خطوات وكواشف متعددة.

ومع ذلك ، فإن هذه التقنية ليست شاقة. على الرغم من أن الأمر قد يستغرق حوالي ثلاثة أيام لإكماله ، إلا أن التدريب العملي في الوقت المحدد لا يتجاوز بضع ساعات كل يوم. في التحضير ، قم بإطعام القراد الذي تم جمعه لمدة 48 إلى 72 ساعة قبل جمع الأمعاء.

لتشريح القناة الهضمية من القراد ، أضف 20 إلى 30 ميكرولترا من محلول MEMFA إلى شريحة زجاجية نظيفة. ثم ضع العلامة في MEMFA ، واضبط التركيز على رأس القراد. الآن ، باستخدام زوج من شفرات الحلاقة المعقمة عالية الكربون المصنوعة من الفولاذ ، قم بتقطيع منطقة الرأس عند الدرع تاركا جسم القراد في لباقة.

بعد ذلك ، اضغط برفق على الجسم لدفع رتج الأمعاء والغدد اللعابية خارج بشرة الجسم. ثم دون الإضرار بالشجاعة ، افصلها بعناية عن الغدد اللعابية وقم بغرف الجروح بعناية على شفرة حلاقة. اجمع كل الأحشاء المحصودة في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر في 500 ميكرومتر من MEMFA.

ثم احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة مع هزاز لطيف لمدة ساعة واحدة. في اليوم التالي ، قم بتجفيف الأنسجة كما هو موضح في بروتوكول النص وتخزينها عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. لتحضير سلة شبكية ، أولا ، استخدم شفرة حافة واحدة ساخنة على مشرط لقطع قيعان أنبوب الطرد المركزي العلوي سعة ملليلتر أو خمسة ملليلتر.

قد تحتاج الشفرة إلى إعادة تسخينها عدة مرات قبل اكتمال القطع. بعد ذلك ، قم بقص مربع من شبكة نايلون 110 ميكرون أكبر قليلا من الفتحات الجديدة. بعد ذلك ، اربط الشبكة بالفتحة عن طريق الضغط برفق على الأنبوب في الشبكة على لوح تسخين مضبوطة على حرارة متوسطة / منخفضة حتى يتم عمل سيل جيد.

بعد أن يبرد ، قم بقص الشبكة الزائدة ، وتأكد من عدم وجود فجوات. اصنع 24 من هذه السلال لتتناسب مع طبق 24 بئر. بعد ذلك ، قم بقطع ثقوب في غطاء صفيحة 24 بئر ، بحيث تمسك شفة سلة العينة بالثقب ولا تسقط من خلالها.

عند الانتهاء ، يجب أن تجلس سلال العينات المجمعة على طول الطريق في الآبار. الآن ، استخدم حامل السلة المجهز هذا لنقل السلال من لوحة إلى أخرى بسهولة نسبية طوال التهجين في الموقع. استخدم لوحين من هذا القبيل بحيث يمكن للآخر الاستعداد للغسيل التالي أثناء احتضان العينة في أحدهما.

يغطي هذا القسم خطوات معينة من التهجين في الموقع. راجع بروتوكول النص للحصول على وصف كامل. للبدء ، انقل كل عينة من الأنسجة الثابتة إلى سلة عينة مصنفة.

قم بتنظيم اللوحة حسب الظروف التجريبية ، وصمة لطيخ ما لا يقل عن خمسة شجاعات لكل حالة. أولا ، أعد ترطيب العينات برفق. تجنب إدخال فقاعات الهواء عن طريق الزيادة التدريجية في نسبة PBS-T إلى الإيثانول في كل غسلة.

خلال اليوم الأول ، بعد خطوة ما قبل التهجين لمدة ساعتين ، بدلا من التخلص من المخزن المؤقت للتهجين ، قم بتخزينه للاستخدام المستقبلي أثناء المقايسة. في وقت لاحق ، عند معالجة العينات بمحلول تهجين المسبار ، قم بتغطية اللوحة بإحكام بورق الألمنيوم لمنع تبخر المحلول. في اليوم الثاني ، قم بتحميل المخزن المؤقت للتهجين المحجوز في لوحة 24 بئر ، وقم بتسخين اللوحة حتى 60 درجة مئوية.

في وقت لاحق من ذلك اليوم ، لإزالة جميع آثار المسبار والمخزن المؤقت للتهجين ، اغسل العينات مرتين باستخدام 2x SSC لمدة ثلاث دقائق لكل غسلة. ثم اغسل العينات ثلاث مرات باستخدام 2x SSC لمدة 20 دقيقة لكل غسلة عند 60 درجة مئوية. ثم قم بإعداد الجسم المضاد الأساسي في المخزن المؤقت المنع.

قم بتحميل 500 ميكرولتر من هذا الخليط في كل بئر. بعد خطوة الحظر ، احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع ساعات تقريبا أو عند أربع درجات مئوية طوال الليل. في اليوم الثالث ، قم بتشغيل تفاعل اللون في الركيزة الملونة.

قم بتغطية لوحة العينة بورق الألمنيوم. وأثناء التفاعل ، تحقق بشكل دوري من الإفراط في التلوين باستخدام مجهر التشريح. في اليوم الرابع ، من المهم احتضان وتبييض صندوق الضوء لأن هذا يسمح بإزالة أي تصبغ في العينات أو التلوين من محلول Bouin ، ويعزز إشارة المسبار من أجل تصور واضح.

ثم بعد الغسيل باستخدام SSC ، انقل عينات الأمعاء بعناية عن طريق قلب السلة إلى طبق جديد مكون من 24 بئرا. أثناء التواجد في الآبار ، اشطف السلال جيدا باستخدام 70٪ من الإيثانول. ثم يسبق تصوير العينات.

من الأهمية بمكان تقدير جودة مجسات الحمض النووي الريبي قبل استخدامها. يمكن فحص المجسات على هلام الفورمالديهايد. إذا ظهرت كأشرطة ساطعة ومنفصلة ، فهي ذات نوعية جيدة.

عند تلطيخ بعض التباين في التوزيع أمر طبيعي بين التكرارات البيولوجية وكذلك بين الأزواج السبعة من الرتج من الأمعاء الفردية. لذلك ، من الأفضل تلطيخ ما لا يقل عن خمس أحشاء لكل حالة للحصول على فكرة عن نمط التلوين المتوسط. من الأفضل قياس النجاح العام من خلال مقارنة تلطيخ عينات الإحساس ومضادات المعنى لكل حالة.

يجب تطوير كلاهما لنفس الفترة الزمنية. يجب أن تحتوي عينات الإحساس على لون أرجواني ضئيل أو معدوم ، بينما يجب أن تعرض العينات المضادة للحساسية تلطيخا قويا مع الحد الأدنى من الخلفية. بشكل حاسم ، يجب أن تظهر الأنسجة بالكامل في البقعة من أجل التعرض المتساوي.

من المهم تجنب الإفراط في تطور تفاعل اللون. يمكن أن يؤدي ذلك إلى قدر كبير من تلطيخ الخلفية ، وقد تبدأ عينات الإحساس في الظهور مثل عينات مضادة للحساس. عامل آخر يؤثر على النتائج هو مقدار تغذية القراد مسبقا.

يصعب التعامل مع القراد غير الذي يتغذى أو يتغذى لمدة 24 ساعة فقط. تتلف أحشائهم بسهولة ولا تلطخ جيدا. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون يومين ونصف إلى ثلاثة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الاحتفاظ بجميع المستلزمات المدرجة في جدول الكواشف والمواد جاهزة قبل بدء تجربتك. شكرا على المشاهدة ، ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.