Pyrosequencing : طريقة بسيطة لالتنميط الجيني دقيقة

استفادت أبحاث علم الوراثة بشكل كبير من إطلاق تسلسل الجينوم البشري. تسلسل Pyro هو نظام فريد يسمح بتحليل التباين الجيني بالإضافة إلى عدم التوازن الأليلي للحمض النووي الريبي والحمض النووي وحالة المثيلة ورقم نسخة الجينات. في هذا الفيديو، نوضح تفاعل تسلسل بايرو الأساسي للتحليل الجيني.

مرحبا ، أنا كريستي كينج من مختبر الدكتور تشارلز إيبي والدكتور بريان غيج في قسم الطب الباطني في كلية الطب بجامعة واشنطن. سنعرض لك اليوم إجراء لتسلسل pyro. هذا الإجراء مفيد لأنه أحد أكثر الطرق شمولا وبساطة المستخدمة لتحليل تعدد الأشكال

يعتمد تسلسل Pyro على التسلسل عن طريق التوليف ، والاستفادة من إطلاق البيروفوسفات كلما تم دمج النيوكليوتيدات في خيط DNA ثلاثي أولي مفتوح. بمجرد تحميل اللوحة ، يتم دمج النيوكليوتيدات بناء على تسلسل يوفره البرنامج بمجرد إطلاقه ، يتم استخدام البيروفوسفات في تفاعل ينتج عنه إطلاق TP ، والذي يستخدمه لوسيفيراز لتحويل لوسيفر إلى أوكسي لوسيفر مما يؤدي إلى انبعاث الضوء. يتم جمع الضوء المقبول بواسطة كاميرا CCD وتسجيله كقمم ، تعرف أيضا باسم الحدايات.

يتم تحلل أي نيوكليوتيدات غير مدمجة في خيط الحمض النووي بواسطة AP pyra لمنع ضوضاء الخلفية. يتضمن هذا الإجراء الخطوات التالية. تصميم الفحص ، الرحلان الكهربائي لهلام PCR لمراقبة الجودة وتسلسل بايرو.

لذلك دعونا نبدأ بتسلسل بايرو. من أجل إجراء تسلسل pyro ، يجب أولا تحضير منتج PCR. يتطلب تفاعل البوليميراز المتسلسل لتسلسل بايرو دورات أكثر من معظم تفاعلات البوليميراز المتسلسل من أجل ضمان استخدام كل التمهيدي حتى 50 دورة تقريبا.

يتطلب تسلسل Pyro أيضا أن يكون أحد بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل بيوتينيلي. أخيرا ، من المهم ملاحظة أن التمهيدي الداخلي مطلوب أيضا. يمكن إجراء تصميم الفحص الفعال باستخدام البرامج المتوفرة من خلال تسلسل pyro لضمان عدم وجود التلوث.

وللتأكد من وجود منتج PCR ، يجب تشغيل الجل على عينات قليلة بالإضافة إلى عنصر تحكم سلبي. لعمل لوحة تسلسل بايرو ، أضف 12 ميكرولترا من مزيج التمهيدي لتسلسل بايرو إلى لوحة تسلسل بايرو 96 جيدا. يتطلب ذلك مزيجا من 43.2 ميكرولتر من البرايمر الداخلي ، جنبا إلى جنب مع 1396.8 ميكرولتر من عازلة الركوع تغطي لوحة تسلسل pyro بغشاء لاصق.

إذا كان الإعداد سيستغرق أكثر من 50 دقيقة لكل بئر من منتج PCR 96 جيدا ، أضف 70 ميكرولترا من مزيج سرعة SRO الذي يحتوي على 240 ميكرولتر من سرعات المصل المطلية بالستربتافيدين. 4 ، 560 ميكرولتر من المخزن المؤقت الملزمة ، وهو مصنوع من كلوريد الصوديوم TRISS و EDTA و 20 و 3 ، 600 ميكرولتر من الماء واستبدل الغطاء بإحكام. ضع لوحة منتج 96 جيدا PCR مع مزيج الخرز في شاكر الطبق لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

تأكد من تأمين الغطاء لمنع أي تلوث متبادل بين الآبار. ستسمح هذه الخطوة بالركوع الشامل للبكتيريا العقدية ENC ، وهي حبات كروية مغلفة على علامة البيوتين الموجودة على برايمر PCR. قم بإعداد محطة عمل لإعداد اللوحات.

يتضمن ذلك أحواض الكاشف ومنتج PCR وصينية خلط الخرز وصينية التمهيدي لتسلسل بايرو. تأكد من محاذاة منتج PCR ولوحة خلط الخرز بالإضافة إلى صينية التمهيدي لتسلسل pyro بشكل صحيح بحيث تكون السلبيات في نفس الاتجاه. قبل نقل العينات ، قم بهز أداة التفريغ ، التي يتم إيقاف تشغيلها بالماء النظيف لتحرير أي حبات أو حطام قد يكون عليها.

تخلص من الماء المتبقي ، وأعد ملء الحوض الصغير ، وقم بتشغيل المكنسة الكهربائية. اترك أداة التفريغ في الحوض حتى تتم إزالة كل الماء ، أي حوالي 30 ثانية. ضع أطراف المرشح الخاصة بأداة التفريغ في آبار لوحة خلط حبة PCR واتركها تبقى حتى تتم إزالة كل السائل من اللوحة.

يمكن استخدام التأرجح اللطيف لمنع التوتر السطحي. ضع الفراغ في حوض الإيثانول بنسبة 70٪ عندما يبدأ السائل في التدفق عبر الأنبوب. اسمح لأطراف المرشح بامتصاص الإيثانول لمدة خمس ثوان.

كرر ذلك مع هيدروكسيد الصوديوم 0.2 مولار، الذي يغير طبيعة الحمض النووي إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل أحادي تقطعت به السبل وللمخزن المؤقت للغسيل. لتنظيف وتحييد منتج PCR. افصل خرطوم التفريغ عن أداة التفريغ وضع أداة التفريغ في لوحة تسلسل pyro التي تحتوي على برايمر تسلسل pyro في مزيج عازلة راكعة.

إذا كان خرطوم التفريغ لا يزال متصلا ، عند وضعه في لوحة تسلسل pyro ، سيتم امتصاص مزيج التمهيدي. النصائح التي تجعلك تفقد منتج PCR الخاص بك. قم بهز أطراف المكنسة الكهربائية برفق أو هزها في آبار لوحة تسلسل بايرو لتفريق منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بك.

قم بإزالة أداة التفريغ من لوحة تسلسل pyro بمجرد اكتمال الاهتزاز أو التأرجح ، وأعد توصيل أداة التفريغ بالخرطوم وضع الأداة في الماء النظيف لتنظيفها للوحة التالية. ضع لوحة تسلسل بايرو على كتلة حرارية لمدة دقيقتين عند 80 درجة مئوية. بعد دقيقتين ، أخرجي الطبق من كتلة الحرارة وضعيه على سطح بارد.

بمجرد التبريد ، يمكن استخدام الفيلم اللاصق لتغطية اللوحة ، ما لم يتم تشغيل اللوحة في غضون 15 دقيقة لمنع التبخر. والآن حان الوقت لبدء تسلسل بايرو. تتمثل الخطوة الأولى في تسلسل pyro في إدخال تفاصيل الفحص في الكمبيوتر.

ضمن إدخال المقطع البسيط ، حدد الإدخال الجديد وأدخل معلومات الفحص ، بما في ذلك اسم المعرف والتسلسل المراد تحليله ، والذي يتم توفيره بواسطة برنامج تصميم الفحص ويسمح بترتيب الإغناء لتحديد مراقبة الجودة ، والذي يوفر التسلسل حول قواعد التحكم SNP plus. أخيرا ، حدد الرسوم البيانية لتوفير صورة مرئية لما يجب أن يبدو عليه pigram. حان الوقت الآن للدخول في تشغيل القصاصة.

ضمن عمليات تشغيل القصاصة وعلامة التبويب العامة ، أدخل اسم تشغيل وحدد معلمات الأداة للتشغيل. ضمن علامة تبويب الإعداد ، حدد إدخال الفحص وانقر واسحب فوق اللوحة. لإدخال الاختبار الذي تختاره في اللوحة الخاصة بك ، من المهم ملاحظة أنه لا يلزم استخدام اللوحة بأكملها حيث يمكنك تعطيل الآبار المختلفة للتحليل ، بالإضافة إلى العديد من المقايسات المختلفة التي يمكن تشغيلها على نفس اللوحة.

انقر فوق علامة التبويب طريقة العرض ثم حدد. ركض. تسرد هذه الصفحة الأحجام المناسبة من النيوكليوتيدات والإنزيم والركيزة اللازمة للتشغيل. نظف كل من النيوكليوتيدات أو الشعيرات الدموية وأطراف الكاشف قبل الاستخدام.

املأ الأطراف بالماء واضغط على الجزء العلوي من الطرف للتحقق من وجود أي انسداد في الأطراف. إذا لم يتدفق الماء من قاع الطرف ، فقم بإفراغه وإعادة تعبئته عدة مرات لمحاولة دفع الماء بالإجبار. أو يمكنك صوتنة النصائح إذا ظل الطرف مسدودا.

تجاهل واحصل على نصائح جديدة. يجب إعادة تعليق الإنزيم والركيزة بالماء قبل الاستخدام. إذا كانت فقاعات الهواء المهتزة يمكن أن تسبب في انسداد الأطراف أو الإعفاء غير المتسق ، فيمكن تخزين الإنزيم والركيزة المعلقة غير المستخدمة عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر.

للاستخدام المستقبلي لأطراف الاستغناء عن الشعيرات الدموية في أنبوب fuge دقيق ، قم بإجراء تخفيف واحد لواحد باستخدام النيوكليوتيدات و te buffer P ثمانية. تخلط جيدا قبل الاستخدام. املأ أطراف النيوكليوتيدات والكاشف بالأحجام المناسبة وفقا للكميات التي يقترحها البرنامج.

قم بتوزيع السائل برفق على جوانب الأطراف لمنع سحب فقاعات الهواء فيها والتسبب في انسداد. تأكد من التحقق من وجود أي فقاعات هواء في أطراف توزيع النيوكليوتيدات. في حالة وجود أي فقاعات هواء، ما عليك سوى النقر على جوانب الأطراف حتى تظهر فقاعات الهواء أو إزالتها بطرف ماصة نظيف.

قم بتشغيل لوحة اختبار بعد ملء الخرطوشة. ضع الخرطوشة في أداة تسلسل pyro ولوحة الاختبار في منصة لوحة الآبار 96. يسمح وضع فيلم لاصق فوق اللوحة برؤية الكاشف والإغناء عن النيوكليوتيدات بسهولة.

حدد علامة تبويب الآلة الموسيقية على الجانب الأيسر من الشاشة، ثم انقر على إدارة. حدد الأداة من القائمة المنسدلة. انقر فوق اختبار ، وسيظهر تحذير.

يطلب منك التحقق من وضع لوحة الاختبار في الجهاز. انقر فوق موافق. بمجرد الانتهاء ، قم بإزالة لوحة الاختبار وفي منتصف اللوحة يجب أن تكون هناك نقاط سائلة فوق ستة من الآبار تمثل أربعة نيوكليوتيدات وإنزيم وركيزة.

إذا كان هناك أقل من ست نقاط صغيرة ، فقد حدث انسداد ويجب فحص الأطراف وإزالتها من أي انسداد. ضع اللوحة في منصة لوحة التسلسل 96 البئر. أغلق جميع الرافعات وانقر فوق تشغيل على اللوحة الفردية.

قم بتشغيل إعداد ركيزة الإنزيم وسيتم توزيع النيوكليوتيدات بالترتيب المحدد مسبقا. بمجرد تحليل التشغيل بواسطة منظم pyro ، فقد حان الوقت لفحص التشغيل. تمثل الآبار الزرقاء نمطا وراثيا عابرا وبيرو.

تدعو آبار أورانج إلى تدخل بشري ويمكن تحريرها بالنقر فوق البئر محل الاهتمام وفتح الرسم البياني المتوقع. قد يتم تمرير النمط الجيني أو فشله أو فحصه ، وكذلك تغيير النمط الجيني نفسه بشكل مناسب. بمجرد تحرير البئر ، ستظهر دائرة مظلمة على خريطة اللوحة.

يجب تصنيف الضوابط السلبية على أنها سلبية. قد تكون هناك قمم غير محددة في الآبار السالبة ، ومع ذلك ، عادة ما يكون سببها تكرار التمهيدي الداخلي. لقد أوضحنا لكم للتو كيفية تسلسل py لتعدد الأشكال في علم الجينوم البشري.

يعد تسلسل DNA Pyro مفيدا على إجراءات التسلسل الأخرى لأنه قابل للتكيف مع مجموعة واسعة من التطبيقات. كما أنها قوية بما يكفي للتعامل مع الحمض النووي من أي مصدر ، بما في ذلك التركيز المنخفض والحمض النووي المتدهور. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تبدأ بمنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل النظيف الجيد.

قم بتضمين عنصر تحكم سلبي لكل اختبار وتأكد من أن جميع الكواشف الخاصة بك جيدة. هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.