Pyrosequencing : طريقة بسيطة لالتنميط الجيني دقيقة

لقد استفادت أبحاث الوراثة بشكل كبير من إصدار تسلسل الجينوم البشري. ويُعد التسلسل بالبيروسيكوينسينج (Pyro sequencing) نظاماً فريداً يتيح تحليل التباين الوراثي بالإضافة إلى عدم التوازن الأليلي للحمض النووي الريبي (RNA)، وحالة مثيلة الحمض النووي (DNA)، وعدد نسخ الجينات. وفي هذا الفيديو، نستعرض تفاعلاً أساسياً للتسلسل بالبيروسيكوينسينج للتحليل الوراثي.

مرحباً، أنا كريستي كينج من مختبر الدكتور تشارلز إيبي والدكتور برايان غيج في قسم الطب الباطني بكلية الطب بجامعة واشنطن. سنعرض لكم اليوم إجراءً للتسلسل البييروسي (pyro sequencing). ويعد هذا الإجراء مفيداً لأنه أحد أكثر الطرق دقة وبساطة المستخدمة لتحليل تعدد أشكال النيوكليوتيدات المفردة (SNPs).

تعتمد تقنية التسلسل البيروسي (Pyro sequencing) على التسلسل عن طريق الاصطناع، وذلك بالاستفادة من تحرر البيروفوسفات كلما تم دمج نوكليوتيدة في شريط DNA مفتوح عند الطرف الثلاثي (three prime). وبمجرد تحميل اللوحة، يتم دمج النوكليوتيدات بناءً على تسلسل يوفره البرنامج. وبمجرد تحرره، يُستخدم البيروفوسفات في تفاعل يؤدي إلى تحرر TP، الذي يستخدمه إنزيم اللوسيفيراز (luciferase) لتحويل اللوسيفيرين (Lucifer) إلى أكسي-لوسيفيرين (oxy Lucifer)، مما يؤدي إلى انبعاث الضوء. ويتم تجميع الضوء المنبعث بواسطة كاميرا CCD وتسجيله على شكل قمم، تُعرف أيضاً باسم pyros.

يتم تفكيك أي نيوكليوتيدات لم تندمج في شريط DNA بواسطة AP pyra لمنع حدوث الضجيج الخلفي. تتضمن هذه العملية الخطوات التالية: تصميم المقايسة، والترحيل الكهربائي لهلام PCR لضبط الجودة، والتسلسل بالبيروسيكوينسينغ.

لنبدأ الآن بعملية التسلسل بالتحلل الحراري (pyrosequencing). من أجل إجراء التسلسل بالتحلل الحراري، يجب أولاً تحضير ناتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يتطلب تفاعل PCR الخاص بالتسلسل بالتحلل الحراري دورات أكثر من معظم تفاعلات PCR لضمان استهلاك جميع البادئات، وذلك بنحو 50 دورة.

تتطلب عملية التسلسل بالبيروسيكوينسينج (Pyro sequencing) أيضاً أن يكون أحد بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) مبيوتناً (biotinylated). وأخيراً، من المهم ملاحظة أن هناك حاجة أيضاً إلى بادئ داخلي. ويمكن إجراء تصميم فعال للمقايسة باستخدام البرمجيات المتوفرة من خلال تقنية التسلسل بالبيروسيكوينسينج لضمان عدم وجود تلوث.

ولتأكيد وجود ناتج PCR، يجب إجراء تحليل بالهلام الكهربائي (gel electrophoresis) لبعض العينات بالإضافة إلى ضابط سلبي. ولتحضير لوحة تسلسل البايرو (pyro sequencing plate)، أضف 12 µL من مزيج بادئ تسلسل البايرو إلى لوحة تسلسل البايرو ذات 96 بئراً. يتطلب ذلك مزيجاً يتكون من 43.2 µL من البادئ الداخلي، مع 1396.8 µL من محلول التخزين المنظم (kneeling buffer)، ثم قم بتغطية لوحة تسلسل البايرو بغشاء لاصق.

إذا استغرق الإعداد أكثر من 50 دقيقة، أضف إلى كل بئر من آبار طبق PCR ذو الـ 96 بئر 70 µL من خليط SRO speed mix الذي يحتوي على 240 µL من sero speeds 4 المغطاة بالستربتفيدين، و560 µL من محلول الربط (binding buffer) المكون من tris وsodium chloride وEDTA وtween 20، و3,600 µL من الماء، ثم أغلق الغطاء بإحكام. ضع طبق PCR ذو الـ 96 بئر الذي يحتوي على خليط الخرز في هزاز الأطباق لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

تأكد من إحكام غلق الغطاء لمنع حدوث أي تلوث خلطي بين الآبار. ستسمح هذه الخطوة بارتباط دقيق لكرات spheros المغلفة بـ strep ENC بالوسم البيوتين الموجود على بادئ الـ PCR. قم بتجهيز محطة عمل لتحضير الأطباق.

يشمل ذلك أحواض الكواشف، وصينية خليط حبيبات ونواتج PCR، وصينية بادئات التسلسل البيروسي (pyro sequencing). تأكد من محاذاة لوحة خليط حبيبات ونواتج PCR وكذلك صينية بادئات التسلسل البيروسي بشكل صحيح بحيث تكون العينات السالبة في نفس الاتجاه. قبل نقل العينات، قم برج أداة التفريغ (vacuum tool) وهي مطفأة في ماء نظيف لتحرير أي حبيبات أو شوائب قد تكون عالقة بها.

تخلص من الماء المتبقي، وأعد ملء الحوض، ثم قم بتشغيل المكنسة الكهربائية (vacuum). اترك أداة السحب في الحوض حتى يتم إزالة جميع المياه، وهو ما يستغرق 30 ثانية تقريباً. ضع رؤوس ترشيح أداة السحب في آبار لوحة خليط حبيبات PCR واتركها حتى يتم سحب جميع السوائل من اللوحة.

يمكن استخدام الهز اللطيف لمنع التوتر السطحي. ضع جهاز التفريغ في حوض الإيثانول بتركيز 70% عندما يبدأ السائل في التدفق عبر الأنابيب. اترك رؤوس المرشحات تمتص الإيثانول لمدة خمس ثوانٍ.

كرر العملية باستخدام هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 0.2 molar، والذي يعمل على مسخ الـ DNA إلى خيوط مفردة لـ PCR، وبالنسبة لمحلول الغسيل، وذلك لتنقية ومعادلة ناتج الـ PCR. افصل خرطوم التفريغ من أداة التفريغ، ثم ضع أداة التفريغ في لوحة التسلسل البيرومي (pyro sequencing) التي تحتوي على بادئ التسلسل البيرومي في مزيج من محلول الـ kneeling buffer.

إذا كان خرطوم التفريغ لا يزال متصلاً، فعند وضعه في لوحة التسلسل الحراري (pyro sequencing plate)، سيتم سحب مزيج البادئات عبر الرؤوس، مما يؤدي إلى فقدان ناتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). قم بهز أو تحريك رؤوس التفريغ برفق داخل آبار لوحة التسلسل الحراري لتوزيع ناتج PCR.

قم بإزالة أداة التفريغ من لوحة التسلسل البيروسي بمجرد اكتمال عملية الرج أو الهز، ثم أعد توصيل أداة التفريغ بالخرطوم وضع الأداة في ماء نظيف لتطهيرها من أجل اللوحة التالية. ضع لوحة التسلسل البيروسي على كتلة حرارية لمدة دقيقتين عند 80 °C. بعد دقيقتين، قم بإزالة اللوحة من الكتلة الحرارية وضعها على سطح بارد.

بمجرد التبريد، يمكن استخدام غشاء لاصق لتغطية الطبق، ما لم يتم تشغيل الطبق في غضون 15 دقيقة لمنع التبخر. والآن حان الوقت لبدء عملية pyro Sequencing. تتمثل الخطوة الأولى من pyro sequencing في إدخال تفاصيل المقايسة في الكمبيوتر.

ضمن إدخال simplex، اختر إدخالاً جديداً وأدخل معلومات المقايسة، بما في ذلك اسم المعرّف (ID) والتسلسل المراد تحليله، والذي يوفره برنامج تصميم المقايسة ويسمح بمراقبة الجودة، ثم اختر ترتيب التوزيع، الذي يحدد التسلسل المحيط بـ SNP بالإضافة إلى القواعد الضابطة. وأخيراً، اختر الرسوم البيانية (histograms) لتوفير تصور لما يجب أن يكون عليه المخطط البياني (pyrogram). الآن حان وقت إدخال تشغيل snip.

ضمن علامة تبويب "العمليات" (runs) والعامة، أدخل اسماً للعملية وحدد معاملات الجهاز الخاصة بها. ومن علامة تبويب "الإعداد" (setup)، اختر إدخال المقايسة ثم انقر واسحب فوق اللوحة. ولإدخال المقايسة المختارة في اللوحة، من المهم ملاحظة أنه ليس من الضروري استخدام اللوحة بأكملها، حيث يمكنك تعطيل آبار مختلفة لاستبعادها من التحليل، كما يمكن إجراء العديد من المقايسات المختلفة على اللوحة نفسها.

انقر فوق علامة تبويب العرض (view) ثم حدد تشغيل (Run). تسرد هذه الصفحة الأحجام المناسبة من النيوكليوتيدات والإنزيم والركيزة المطلوبة لعملية التشغيل. قم بتنظيف كل من رؤوس النيوكليوتيدات أو الشعيرات ورؤوس الكواشف قبل الاستخدام.

املأ الرؤوس بالماء وطبق ضغطاً على الجزء العلوي من الرأس للتحقق من وجود أي انسدادات. إذا لم يندفع الماء من أسفل الرأس، قم بتفريغه وإعادة ملئه عدة مرات لمحاولة دفع الماء عبره. أو يمكنك استخدام جهاز السونيكيشن (sonicate) للرؤوس إذا ظل الرأس مسدوداً.

تخلص من الرؤوس المستخدمة واستخدم رؤوساً جديدة. يجب إعادة تعليق الإنزيم والركيزة بالماء قبل الاستخدام. ولأن الرج قد يؤدي إلى تكون فقاعات هوائية تسبب انسداد الرؤوس أو عدم اتساق في التوزيع، يمكن تخزين الإنزيم والركيزة التي تمت إعادة تعليقها ولم تُستخدم في درجة حرارة 20- درجة مئوية.

للاستخدام المستقبلي لرؤوس التوزيع الشعيرية في أنبوب طرد مركزي دقيق، قم بإجراء تخفيف بنسبة 1:1 باستخدام النيوكليوتيدات والمحلول المنظم te buffer P eight. اخلط المزيج جيدًا قبل الاستخدام. املأ رؤوس النيوكليوتيدات والكواشف بالأحجام المناسبة وفقًا للكميات التي يقترحها البرنامج.

قم بتوزيع السائل برفق على جدران الرؤوس لتجنب سحب فقاعات هوائية بداخلها مما قد يؤدي إلى حدوث انسدادات. تأكد من فحص رؤوس توزيع النيوكليوتيدات للتأكد من خلوها من أي فقاعات هوائية. وفي حالة وجود أي فقاعات، قم ببساطة بالنقر على جوانب الرؤوس حتى تطفو الفقاعات على السطح أو قم بإزالتها باستخدام رأس ماصة نظيف.

قم بتشغيل لوحة اختبار بعد ملء الخرطوشة. ضع الخرطوشة في جهاز التسلسل بالبيروسيكوينسينج (pyro sequencing) ولوحة الاختبار في منصة الألواح ذات الـ 96 بئراً. يتيح وضع غشاء لاصق فوق اللوحة رؤية عملية توزيع الكواشف والنوكليوتيدات بسهولة.

اختر علامة تبويب الجهاز (instrument) الموجودة على الجانب الأيسر من الشاشة، ثم انقر فوق إدارة (manage). اختر الجهاز من القائمة المنسدلة، ثم انقر فوق اختبار (test)، حيث سيظهر تحذير.

يُطلب منك التحقق من وضع لوحة الاختبار في الجهاز. انقر فوق موافق. بمجرد الاكتمال، قم بإزالة لوحة الاختبار، حيث يجب أن تظهر نقاط سائلة في منتصف اللوحة فوق ستة من الآبار، تمثل أربعة نيوكليوتيدات، والإنزيم، والركيزة.

إذا كان عدد النقاط الصغيرة أقل من ست، فهذا يعني حدوث انسداد، ويجب فحص الرؤوس وإزالة أي انسدادات منها. ضع اللوحة في منصة لوحة تسلسل pyro ذات 96 بئراً. أغلق جميع الروافع وانقر على تشغيل (run) للوحة الفردية.

قم بإعداد التشغيل، حيث سيتم توزيع الإنزيم والركيزة والنيوكليوتيدات بالترتيب المحدد مسبقاً. وبمجرد قيام جهاز التسلسل البيرومي (pyro sequencer) بتحليل التشغيل، يحين وقت فحص النتائج. تمثل الآبار الزرقاء نمطاً جينياً ناجحاً وعملية تسلسل بيرومي صحيحة.

تتطلب الآبار البرتقالية تدخلاً بشرياً ويمكن تحريرها من خلال النقر على البئر المطلوب وفتح المدرج التكراري المتوقع. يمكن اعتبار النمط الجيني ناجحاً أو راسباً أو مراجعاً، بالإضافة إلى إمكانية تغيير النمط الجيني نفسه بشكل مناسب. وبمجرد تحرير البئر، ستظهر دائرة داكنة على خريطة الطبق.

يجب تقييم الضوابط السلبية على أنها سلبية. قد تظهر قمم غير محددة في الآبار السلبية، ومع ذلك، فإن ذلك ينتج عادةً عن تشكّل حلقات في البادئ الداخلي. وبذلك، نكون قد أوضحنا لكم كيفية تسلسل تعدد الأشكال في الحمض النووي الجينومي البشري باستخدام تقنية py.

تعد تقنية تسلسل الحمض النووي بطريقة Pyro sequencing أكثر فائدة من إجراءات التسلسل الأخرى لأنها قابلة للتكيف مع مجموعة واسعة من التطبيقات. كما أنها تتميز بالقوة الكافية للتعامل مع الحمض النووي من أي مصدر، بما في ذلك الحمض النووي منخفض التركيز أو المتحلل. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر البدء بمنتج PCR نظيف وجيد.

قم بتضمين ضابط سلبي لكل مقايسة وتأكد من جودة جميع الكواشف المستخدمة. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.