سهلة ودقيقة والميكانيكية التنميط على Micropost صالحة

الهدف العام لهذه التقنية هو جمع الخصائص البيولوجية الميكانيكية ذات الصلة من الخلايا المفردة المعزولة من خلال تصور القوى الناتجة عن تفاعلات ركيزة الخلية المميزة باستخدام الفحص المجهري الضوئي القياسي. الطريقة المقدمة هي تقنية منصة لعلم الأحياء الميكانيكي. يمكن أن يساعد في التحقيق في الأسئلة الرئيسية في أبحاث السرطان ، مثل دور تقلص الخلايا في ورم خبيث للخلايا السرطانية.

تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها تستخرج بقوة المعلومات العصبية البيولوجية مع القليل من تدريب المستخدم. وهو متوافق مع الفحص المجهري الضوئي القياسي وهو موجه نحو الإنتاجية العالية. ثالثا ، توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة للخصائص البيولوجية الميكانيكية لخلايا سرطان العظام البشرية.

يمكن أيضا تطبيقه على أنواع الخلايا التلقائية مثل خلايا الموسكو الملساء أو خلايا عضلة القلب. ابدأ بوضع الركيزة الزجاجية بحيث تواجه مصفوفة المنشورات الدقيقة لأعلى في بئر لوحة 12 بئر ، أضف بشكل غير مباشر ملليلترا واحدا من 99٪ من الإيثانول إلى البئر بحيث يتم تغطية الركيزة. تأكد من عدم وجود فقاعة أثناء أي خطوات لمعالجة السائل ، وأن مصفوفة الوظائف الدقيقة مغطاة دائما بطبقة رقيقة من السائل.

ثم احتضان المصفوفة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 إلى 30 ثانية قبل إضافة مليلتر واحد من الماء منزوع الأيونات المعقم على جانب البئر. بمجرد أن يختلط مع الإيثانول ، استنشق ما يقرب من ملليلتر واحد من محلول الإيثانول من البئر وأضف ملليلترا إضافيا من الماء منزوع الأيونات. كرر هذه العملية ثلاث مرات على الأقل لتبليل العينة.

بعد ذلك ، استبدل الماء منزوع الأيونات في البئر ب PBS بنفس الطريقة عن طريق إضافة ثم شفط ما يقرب من ملليلتر واحد في المرة الواحدة لثلاث تكرارات. ثم استخدم نفس العملية لاستبدال PBS بالمتوسط. الآن بعد أن تمت تغطية المصفوفة بحوالي ملليلتر واحد من الماصة المتوسطة 25 ، 000 خلية ذات أهمية في مليلتر واحد من الوسط في البئر مع مجموعة منشورات صغيرة مجهزة.

ثم أغلق اللوحة متعددة الآبار وانقلها إلى حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. دع الخلايا تلتصق وتنمو فوق الأعمدة الدقيقة لمدة ست إلى سبع ساعات ، مع فحص عملية الالتصاق. من حين لآخر باستخدام مجهر ضوئي ، قم بشفط الوسط من البئر ثم اغسل الخلايا مرتين باستخدام مليلتر واحد من PBS.

تأكد من تطبيق قوة لطيفة أثناء الغسيل باستخدام PBS لإزالة بقايا الخلية المتراكمة على مصفوفة الوظائف الدقيقة أثناء الحضانة وفصل الخلايا الميتة. بعد ذلك ، أضف 0.5 مل من محلول الفورمالديهايد المخزن بنسبة 3.7٪ لمدة خمس دقائق لإصلاح الخلايا. ثم قم بإزالة محلول الفورمالديهايد واغسل مصفوفة المنشورات الدقيقة مرتين باستخدام مليلتر واحد من الماء المعقم منزوع الأيونات.

لكل غسلة ، قم بتغطية الخلايا الثابتة بصبغة زرقاء لامعة 0.05٪ kumasi في 50٪ ماء و 40٪ إيثانول و 10٪ حمض الأسيتيك لمدة 90 ثانية تقريبا ، اغسل محلول التلوين الزائد بشطفتين في مليلتر واحد من الماء المعقم منزوع الأيونات. ثم أضف ملليلترا واحدا من الماء منزوع الأيونات إلى مصفوفة المنشورات الدقيقة وتحقق من نتيجة التلوين تحت المجهر الضوئي. ابدأ بإضافة ملليلترين من الماء منزوع الأيونات إلى طبق بتري ذو قاع زجاجي رفيع باستخدام زوج من الملقط ، وانقل مصفوفة الأعمدة الدقيقة من لوحة 12 بئر إلى طبق التصوير مع عمود صغير متجها لأعلى.

ثم ضع طبق بتري التصويري على المسرح المتحرك للمجهر الضوئي. إذا لم يتم تصحيح بصريات المجهر إلى ما لا نهاية ، فقم بتدوير حلقة التعويض للعدسة المستخدمة في التصوير حتى يمثل الرقم الموجود على المقياس السماكة الإجمالية لجميع المواد على طول المسار البصري. بعد ذلك ، قم بإزالة أي حلقات تباين للوجه من المسار البصري لتمكين وضع المجال الساطع العادي ، ثم قلل القزحية على جانب الإضاءة لأسفل إلى 50٪ قم بمحاذاة طبق بتري بحيث تشكل المشاركات الدقيقة للمصفوفة إما خطا أفقيا أو رأسيا عبر مجال المراقبة.

حدد نقطة البداية في أعلى اليسار وحرك طبق بتري خطوة بخطوة عبر المرحلة. مسح مصفوفة المنشورات الدقيقة أثناء التقاط العديد من الصور عالية الدقة بهدف 20 × أو 40 ×. اهدف إلى الحصول على خلية واحدة في وسط كل صورة في كل موضع جديد.

قم بتمرير ZXs من أسفل العمود الصغير باتجاه طرف العمود الصغير حتى يصبح الطرف في بؤرة التركيز. باستخدام عجلة الضبط الدقيق من المجهر. ثم اخفض مستوى التركيز بمقدار اثنين إلى ثلاثة ميكرون باتجاه الجزء السفلي من المنشور الصغير.

ابدأ بتحميل البرنامج mec وملف التعريف والتحميل في مجموعة من الصور التي تحتاج إلى تحليل بالنقر فوق فتح الصور وتحديدها. بعد ذلك ، انتقل إلى قسم الإعداد وأدخل المعلمات حسب تعليمات دليل البرنامج. ثم قم بتحليل الصور واحدة تلو الأخرى.

ابدأ بتحديد زر الاقتصاص ثم انقر واسحب لتشكيل مخطط مستطيل حول منطقة الاهتمام. عند الانتهاء ، انقر نقرا مزدوجا داخل المستطيل المرسوم لإنهاء الإجراء. بعد ذلك ، حدد رسم مخطط خلية واستخدم مؤشر الشعر المتقاطع لرسم مخطط تفصيلي حول جميع المشاركات الدقيقة التي تغطيها الخلية المرئية في الصورة.

تجاهل أي منشورات صغيرة غير مرغوب فيها عن طريق النقر فوق لتجاهل المنشورات واستخدام مؤشر الشعر المتقاطع للرسم. ثم أرفق جميع المشاركات الصغيرة التي تنتمي إلى خلية خارج قسم الصورة أو التي يتم انحرافها لأي سبب آخر ، ولكن ليس بواسطة الخلية ذات الاهتمام. بعد ذلك ، انقر فوق البحث عن OIDs لبدء الروتين الفرعي للبرنامج.

اضبط إعداد الفلتر بجوار زر البحث عن OIDs مباشرة حتى يتم تسجيل جميع المنشورات الصغيرة ، والتي يتم رؤيتها بواسطة الصليب الأحمر في وسطها. إذا كان هناك العديد من مواضع المنشورات الصغيرة أو المفقودة ، فاستخدم وظيفة التحرير اليدوي بالنقر فوق التحرير اليدوي واستخدم شعر الماوس المتقاطع لتحديد المنشور الصغير المعني. انقر نقرا مزدوجا داخل المستطيل وضع علامة حمراء واحدة في قسم الصورة المكبرة ، والتي تغلق تلقائيا.

ابحث عن شبكة المنشورات الصغيرة المثالية عن طريق تنشيط وظيفة إنشاء الشبكة بنقرة بالماوس. تأكد من أن الموضع يتوافق مع رأس العمود الصغير الحقيقي الموضح بحلقة زرقاء داخل خط مخطط الخلية المرسوم. بعد ذلك ، قم بتصحيح أي علامات شبكية في غير محلها داخل منطقة الخلية عند الحاجة.

باستخدام وظيفة التحرير اليدوي المقابلة بنقرة بالماوس ، استخدم الشعيرات المتقاطعة لتحديد سؤال النشر الصغير عن طريق النقر فوقه وسحبه. انقر نقرا مزدوجا داخل المستطيل الظاهر وضع العلامة الزرقاء المصححة في قسم الصورة المكبرة ، والذي يتم إغلاقه تلقائيا. ثم انقر فوق حساب الانحرافات للحصول على رسم بياني لقيم الانحراف المحسوبة بناء على الفرق بين موضع المنشور الصغير داخل قسم الصورة والشبكة المثالية التي تم إنشاؤها.

أخيرا ، احفظ التحليل الكامل ، بما في ذلك جداول القيم. استمر في تحليل الصورة إما عن طريق النقر فوق إعادة تعيين العرض لتحليل قسم صورة آخر أو النقر فوق عرض الصورة التالي. تفعيلك. فيما يلي مثال على التنميط المينومي لخطين من خلايا سرطان العظام Q oh تسع خلايا ، والتي لها إمكانات نقيلية منخفضة ، وكانت خلايا M 132 شديدة النقائل مثبتة على ارتفاع من نفس دفعة الإنتاج.

تظهر النتيجة أن Q oh تسع خلايا تميل إلى تطبيق قوة أكبر في نقاط التعلق الخاصة بها من الخلايا شديدة النقائل عن طريق تصنيف قيم القوة. فيما يتعلق بمساحة الخلية ، يجد المرء أن متوسط القوة لكل خلية مرتفع لتسع خلايا huo مقارنة ب M 132. أيضا ، يزداد متوسط القوة لكل منشور صغير مع انتشار الخلايا حتى يصل متوسط القوة لكل وظيفة إلى قيمة أكثر استقرارا.

بصرف النظر عن الاختلافات في التباينات المورفولوجية يمكن قياسها بنتائج مثيرة للاهتمام. على سبيل المثال ، على عكس خلايا M 132 شديدة النقيلي ، والتي تميل إلى شغل عدد أقل من المشاركات الصغيرة ، تقدم خلايا HU oh التسع مظهرا غير متجانس من حيث تغطية المنشورات الدقيقة. باختصار ، يكشف ملف تعريف Meno لخط الخلية الأبوية HU oh nine أنهم عادة ما يغطون مساحة أكبر ويطبقون قوة أكبر قليلا على المشاركات الصغيرة.

في حين أن خط الخلية النقيلي M 132 ونوع الخلية العدوانية يغطي بشكل مميز عددا أقل من المشاركات الصغيرة ويطبق قوة أقل لكل منشور صغير. أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تضع في الأنابيب بعناية فائقة وعدم القيام بذلك مباشرة على مصفوفة الوظائف الصغيرة. تجنب إدخال أي فقاعات لأنها تؤدي إلى انهيار المنشورات الصغيرة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخراج المعلومات البيولوجية من الخلايا المفردة المعزولة باستخدام برج الحمل الصغير جنبا إلى جنب مع ملف تعريف الشبكة أو البرنامج. استمتع بنتائجك.