التحول الطبيعي، والتعبير عن البروتين، والحفظ بالتبريد لثغرة البكتيريا الزرقاء الخيطية الفيرميديوم

Phormidium lacuna هي بكتيريا زرقاء خيطية تم عزلها من برك الصخور البحرية. تصف هذه المقالة عزل الخيوط عن المصادر الطبيعية ، واستخراج الحمض النووي ، وتسلسل الجينوم ، والتحول الطبيعي ، والتعبير عن sfGFP ، والحفظ بالتبريد ، وطرق الحركة.

يصف هذا البروتوكول كيف يمكن تحويل البكتيريا الزرقاء الخيطية التي تنتمي إلى المذبذبات عن طريق التحول الطبيعي. كما يوضح كيف يمكن دراسة أنواع مختلفة من الحركة. التحول الطبيعي هو أبسط تقنية تحويل ، إذا كانت تعمل.

مطلوب فقط الحمض النووي والخلايا ووسط النمو. حتى الآن ، لا يمكن تحويل أي عضو آخر في الذبذبات عن طريق التحول الطبيعي. نأمل أن تحفز دراساتنا المجموعات الأخرى على تجربة الذبذبات الأخرى.

من أجل التحول ، قم بعمل ثقافة جيدة وصحية المظهر وإعداد جيد للحمض النووي. بالنسبة لدراسات الحركة ، استخدم دائما ثقافة معالجة بالموجات فوق الصوتية. يجب أن يكون العلاج طازجا.

ستوضح الإجراء نورا ويبر ، وهي فنية من مختبري. ابدأ بتلقيح 50 ملليلتر سائل F2 متوسط في كل من قارورتين سعة 250 ملليلتر مع ملليلتر واحد من خيوط P.lacuna من ثقافة الجري. تزرع في ضوء أبيض تحت الإثارة لمدة خمسة أيام تقريبا عند 25 درجة مئوية.

بعد خمسة أيام ، قم بتجانس 100 ملليلتر من تعليق خلية P.lacuna عند 10،000 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث دقائق وقياس الكثافة البصرية عند 750 نانومتر. ثم ، الطرد المركزي لتعليق الخلية لمدة 15 دقيقة في 6،000 مرات G.قم بإزالة المادة الفائقة وتعليق الكريات في 800 ميكرولتر من السائل المتبقي و F2 + الوسط الإضافي. خذ ثمانية ألواح F2 + Bacto agar تحتوي على 120 ميكروغرام لكل ملليلتر كاناميسين وماصة 10 ميكروغرام من الحمض النووي في منتصف كل صفيحة أجار.

ماصة على الفور 100 ميكرولتر من تعليق الخلية على رأس الحمض النووي. احتفظ بلوحة الأجار بدون غطاء على المقعد النظيف للسماح للسائل الزائد بالتبخر. أغلق اللوحة وازرعها في ضوء أبيض عند 25 درجة مئوية لمدة يومين.

بعد يومين ، قم بتوزيع خيوط كل صفيحة أجار على عدة ألواح أجار F2 + Bacto طازجة تحتوي على 120 ميكروغرام لكل ملليلتر كاناميسين مع حلقة تلقيح. قم بزراعة الألواح في الضوء الأبيض عند 25 درجة مئوية وتحقق من الثقافات بانتظام تحت المجهر. بعد 14 إلى 28 يوما ، حدد الخيوط البنية الميتة وابحث عن الخيوط المتحولة تحت المجهر.

تبدو الخيوط المحولة صحية وخضراء وتختلف عن الجزء الأكبر من الخيوط. انقل كل خيط محول إلى قوارير سعة 50 ملليلتر مع 10 ملليلتر من F2 + متوسطة مع 250 ميكروغرام لكل ملليلتر كاناميسين. تزرع في الضوء الأبيض عند 25 درجة مئوية على شاكر ومراقبة النمو لمدة تصل إلى أربعة أسابيع.

انقل الخيوط مرة أخرى إلى وسط الأجار الذي يحتوي على 250 ميكروغرام لكل ملليلتر كاناميسين وانتظر حتى تنمو الخيوط. ثم ، قم بزيادة تركيز الكاناميسين مرة أخرى لتسريع الفصل. بالنسبة لتعبير GFP ، لاحظ خيوط مفردة باستخدام مجهر فلوري عند تكبير 40X أو 63X والتقط صورة انتقال المجال الساطع وصورة التألق.

قم بزراعة P.lacuna في وسط F2 أقل من 50 دورة في الدقيقة في الضوء الأبيض لمدة خمسة أيام تقريبا حتى تصبح الكثافة البصرية المقدرة عند 750 نانومتر 0.35. قم بتخزين العينة عند أربع درجات مئوية. تجانس الخيوط بالموجات فوق الصوتية لمدة دقيقة واحدة بأقصى طاقة ودورة واحدة.

قياس الكثافة البصرية عند 750 نانومتر ونقل ثمانية ملليلترات من الوسط الذي يحتوي على P.lacuna إلى طبق بتري بطول ستة سنتيمترات. انتظر لبضع دقائق حتى تصل العينة إلى درجة حرارة الغرفة ثم قم بتغطية طبق بتري بورق السيلوفان. ضع شريحة مجهر على طاولة X-Y الخاصة بالمجهر القياسي باستخدام كاميرا.

قم بتشغيل ضوء المجهر وحرك هدفا 4X أو 10X في مسار الضوء. ثم ضع طبق بتري فوق الشريحة. اضبط الخيوط المفردة أو حزم الخيوط حسب حركات X و Y و Z في الجدول.

راقب حركات خيوط أو حزم مفردة وسجل الحركات باستخدام كاميرا مجهر قياسية. تأكد من أن العدسة الموضوعية لا تلمس السائل. ماصة 0.5 ملليلتر من محلول يحتوي على P.lacuna على سطح Bacto agar لطبق بتري طوله ستة سنتيمترات.

اسمح للسائل بدخول السطح. بعد حوالي 20 دقيقة ، أغلق طبق بتري وراقب حركة الخيوط على السطح باستخدام هدف 4X أو 10X. التقط تسجيلات الفاصل الزمني باستخدام كاميرا العين ونظام الكمبيوتر الصغير.

يجب أن تركز الخيوط أولا بالعين ثم من خلال كاميرا العين. تأكد من أن الفاصل الزمني بين الصور اللاحقة هو خمس ثوان إلى دقيقة واحدة. قم ببرمجة البرنامج النصي Linux للكمبيوتر المصغر للتحكم في تسجيل الفاصل الزمني.

قم بإعداد حاملات LED حيث يتم تركيب مصابيح LED مقاس 5 ملليمترات لتشعيع مساحة 20 ملم مربع من الأسفل إلى الأعلى. قياس وضبط كثافة LED. تأكد من أن الإعداد بأكمله في غرفة مظلمة أو حاوية مغلقة مظلمة.

ضع ثمانية ملليلترات من الوسط الذي يحتوي على P.lacuna في طبق بتري بطول ستة سنتيمترات ، وأغلق طبق بتري بالغطاء ، وضعه على حامل LED بحيث يكون LED في وسط طبق Petri. بعد يومين عادة ، التقط صورة لطبق بتري باستخدام كاميرا هاتف ذكي موجهة مباشرة إلى موضع المعالجة الضوئية. استخدم حاملا وورقة بيضاء كخلفية لضمان نفس المسافة وظروف الإضاءة لكل صورة.

افتح برنامج ImageJ ، وانقر فوق ملف ، وفتح ، وحدد الملف. ثم انقر فوق Enter. حدد الزر المستقيم واضغط على زر الماوس الأيسر لرسم خط من أحد طرفي طبق Petri إلى الطرف الآخر.

تأكد من أن الخط يمر عبر مركز دائرة الخيوط. انقر على تحليل وقياس لمعرفة طول طبق بيتري. ثم انقر فوق تحليل ورسم ملف التعريف في قائمة ImageJ.

تقدير قيمة متوسطة لكثافة البيكسل خارج الدائرة وقيمة متوسطة أخرى لكثافة البيكسل داخل الدائرة. أشر بالماوس على موضع Y بين هذه القيم لتقدير قيم X لكلا جانبي الدائرة. لاحظ كلا القيمتين واحسب الفرق.

ثم حدد الزر المستقيم وارسم خطا عند القيمة القصوى المتوسطة لكثافة البكسل. أخيرا ، انقر فوق تحليل ثم قياس للحصول على طول دائرة الخلية الداخلية. يظهر هنا تكامل وفصل الإدراج بعد تحويل P.lacuna مع PAK1.

عادة ما يحتوي اختبار PCR مع الاشعال الخارجي بعد حوالي أسبوع واحد من التحول على شريطين على هلام الرحلان الكهربائي ، أحدهما بحجم النطاق البري ، والآخر أبطأ في الترحيل يشير إلى إدخال كاسيت المقاومة. هنا ، تمثل الممرات من 1 إلى 4 منتجات PCR من الخيوط بعد سبعة أيام و 11 يوما و 14 يوما و 17 يوما من عزل خيوط مقاومة ، ويمثل الممر 5 منتج PCR من النوع البري. في عينة الأيام السبعة ، يكون الإدراج موجودا في جزء صغير من الكروموسومات.

يزداد هذا الكسر حتى 17 يوما ، حيث لا يوجد نطاق من النوع البري مرئيا ؛ أي أن الفصل كامل. تمثل هذه الصورة المتجه pMH1 للتعبير عن sfGHP تحت سيطرة مروج بيتا فيكوسيانين الداخلي. يظهر تسلسل P.lacuna المتماثل ، والعمود الفقري المتجه pUC19 ، وإدراج مع مقاومة sfGFP و kanamycin هنا.

في pMH1 ، يتم وضع جين sfGHP ثلاثة رئيس من جين بيتا phycocyanin ؛ وبالتالي ، يتم تشغيله من قبل مروج بيتا CPC الداخلي. يتم عرض صور التألق لخيوط P.lacuna من النوع البري وبعد التحول مع PAK1 و PAK2 و PAK3 و pMH1 هنا. يتم توجيه تعبير sfGFP بواسطة مروج cpc 560 أو مروج a2813 أو مروج psbA2S أو مروج بيتا CPC الداخلي.

تظهر الصور المدمجة المعروضة هنا حركية ثغرة Phormidium. تظهر الحركة على سطح الأجار هنا. كان الفاصل الزمني دقيقة واحدة.

يتم عرض الحركة في الوسط السائل هنا. كان الفاصل الزمني 10 ثوان. التحول الطبيعي هو طريقة بسيطة.

ما عليك سوى خلط الحمض النووي البلازميدي مع كاسيت المقاومة في تسلسلات متماثلة مع الخلايا والسماح للخلايا بالنمو على وسط بالمضادات الحيوية. يمكن تعطيل الجينات ويمكن الإفراط في التعبير عن البروتينات. هذا مهم لأي بحث أساسي وللدراسات التقنية الحيوية.

في البكتيريا الزرقاء أحادية الخلية حيث يتم إنشاء التحول الطبيعي أيضا ، تمت معالجة الدراسات الجزيئية حول التمثيل الضوئي أو المستقبلات الضوئية ، وما إلى ذلك.