توصيف الميوسين بيرميثيل O-glycans باستخدام الامتصاص بالليزر بمساعدة المصفوفة / قياس الطيف الكتلي لوقت الرحلة

نحن ندرس علم السكر الجليكوبيولوجي لتفاعلات الميكروبات المضيفة في الجهاز الهضمي مع التركيز على دور طبقة المخاط التي تغطي الجهاز الهضمي، وخاصة الموسينات وجليكانتها في الصحة والأمراض. تعرف الجليكانات الميوسين بشكل متزايد كعوامل مهمة في تفاعلات المضيف والميكروبات لأنها توفر المغذيات ومواقع الارتباط للبكتيريا. يمكن أن يؤدي تغيير في ملف الجليكوزيل إلى اضطراب في التركيب الميكروبيوتيكي والعكس صحيح، وهي أنماط ظاهرية شائعة في حالات المرض.

ومع ذلك، فإن المخاط معروف بصعوبة دراسته لأنه يحتوي على غليكوزيل عالي. يمكن للابتكارات في تقنيات أخذ العينات والتحليل المعلوماتي الحيوية اللاحق أن تدفع المجال إلى الأمام، بالإضافة إلى طرق معالجة عينات جديدة لزيادة معدل الإنتاجية وتقليل الوقت من جمع العينات حتى النتائج. تسمح تقنيات تحليلية أخرى بتوصيف هيكلي أكثر تفصيلا للجليكان، لكنها تتطلب وقتا طويلا للتشغيل والتحليل.

التقنية الموصوفة هنا باستخدام مطيافية الكتلة MALDI-TOF تتميز بالسرعة، مما يجعلها عالية الإنتاجية ومناسبة للفحص والتحليل النفسي. للبدء، اخلط المخاط المنقى مع 250 ميكرولتر من محلول إزالة البيتا في قارورة زجاجية سعة أربعة ملليتر. أغلق القارورة بإحكام بغطاء مبطن بالبولي تترافلورو إيثيلين وحضن التفاعل عند 45 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.

على الثلج، أضف ملليتر واحد من محلول حمض الأسيتيك بنسبة 5٪ إلى خليط التفاعل بطريقة قطرة. لإزالة الملح من العينة، قم بسد ماصة زجاجية بكمية صغيرة من الصوف الزجاجي. أضف 1.5 ملليلتر من تعليق الراتنج إلى الماصة الزجاجية من الأعلى، ثم دعها تستقر وتصرف.

الآن، اغسل الراتنج بملليلتر من حمض الأسيتيك 5٪ وتخلص من تدفق الريزر. ثم أضف عينة الموسين إلى عمود إزالة الملح واجمع التدفق في أنبوب سعة خمسة ملليلتر. اغسل العمود مرتين بملليتر واحد من حمض الأسيتيك 5٪ لجمع تدفق الجريان.

ثم باستخدام مبخر طرد مركزي، أزل حمض الخليك وركز العينة على درجة حرارة خمسة مليبار و30 درجة مئوية لمدة ساعتين. قم بإذابة العينة في 0.5 ملليلتر من حمض الأسيتيك الميثانوليك، وجففها تحت تدفق من النيتروجين. باستخدام حقنة زجاجية، أضف أربعة ملليلتر من DMSO إلى القارورة التي تحتوي على خليط هيدروكسيد الصوديوم والميثانول.

بعد الدوامة، قم بعمل طرد مركزي على حرارة 2,000 جرام لمدة دقيقتين. قم بفرج السوبرناتينت بحذر وإزالة الأملاح دون إزعاج الهلام. بعد التأكد من عدم تكون المزيد من الأملاح، أعد تعليق الجل في أربعة ملليتر من DMSO اللامائي لتحضير تعليق قاعدة النفاذ.

بعد ذلك، إلى عينة الموسين المجففة، أضف DMSO اللامائي وقاعدة النفث مباشرة تليها يودوميثان. حضن تفاعل النفاذ لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع هز قوي. ثم أضف 0.5 ملليلتر من الماء لإنهاء التفاعل.

بعد أن تصبح العينة عكرة، اغسلها بالنيتروجين حتى تصبح صافية. حمل العينة على لوحة استخراج توازن دهون محبة للماء بسعة 96 بئرا. تطبيق ضغط موجب لدفع العينات عبر الطور الصلب بمعدل تدفق يقارب ملليلتر واحد في الدقيقة.

بعد التخلص من التدفق الزائد، غسل الآبار مرتين بملليلتر واحد من الماء. قم بإخراج الجليكانات من الصفيحة مرتين باستخدام ملليلتر واحد من الميثانول. اطبق الضغط فقط حتى يبدأ الميثانول بالخروج من اللوح، ثم اترك تدفق الجاذبية للحفاظ على المعدل المطلوب.

جفف العينة باستخدام مبخر طرد مركزي وذوبها في 10 ميكرولتر من TA50. بعد خلط ميكرولتر واحد من العينة والمصفوفة، قم بتحميلها على لوحة هدف فولاذية من MALDI ودعها تجف. لتحليل البيانات، قم بتحميل ملف ASCII المصدر لطيف الكتلة في GlycoWorkbench.

بعد إجراء تصحيح خط الأساس، احسب مراكز المركز في النافذة المنبثقة واختر نطاق الكتلة المناسب، وأقل نسبة إشارة إلى ضوضاء، وأقل شدة ذروة لقياس الطيف الكتلي. ثم استخدم أداة Glyco-Peakfinder لتحديد تركيبات التركيب التي تتطابق مع قائمة القمة. اختر perMe كاشتقاق، وRedEnd كطرف مختزل، وحدد الحد الأدنى والأعلى لعدد البقايا المتوقعة.

بالنسبة للميوسينات، اختر الهيكسوز، وN-أسيتيل-هيكسوامين، والديوكسي-هيكسوزي، وحمض N-أستيل نورامينيك. بالنسبة للجليكانات الكبريتية، استخدم خيار البقايا الأخرى بكتلة 87.9. بالنسبة لبيانات MALDI-TOF، اضبط الحد الأقصى لعدد أيونات الصوديوم والشحنات إلى واحدة لكل منها، واضبط الدقة إلى 0.5 دالتون.

اختر جميع التعليقات الصحيحة باستخدام زر التحكم وانقر على كل واحدة منها. انقر بزر الفأرة الأيمن على التعليقات المحددة واختر إضافة إلى قائمة القمم المشروحة. لإنشاء تقرير يقارن بين عدة أطياف مشروحة، اذهب إلى الأدوات متبوعا بالتقارير وأنشئ تقريرا يقارن بين الملفات الشخصية.

اطبع التقرير كملف PDF لحفظه. لتحليل أطياف التجزئة، قم بتحميل الأطياف على GlycoWorkbench وأنشئ قائمة القمم كما هو موضح سابقا. ارسم هياكل جليكان مفترضة تتوافق مع تركيبات الجليكان المشروحة.

لإنشاء شظايا لكل هيكل، انقر بزر الفأرة الأيمن لاختيار نسخ الشظايا إلى القماش واختر حساب الشظايا تحت أداة الشظايا. لمزيد من تحليل التجزئة، انقر على قمة الاهتمام في عارض الطيف. انقر بزر الفأرة الأيمن واختر العثور على جميع الهياكل التي تطابق القمم للاستعلام عن نسبة الرسوم الرئيسية للقمة المختارة مقابل قواعد البيانات الإلكترونية.

اختر الهياكل المحتملة ذات الاهتمام وانقر بزر الفأرة الأيمن لنسخها إلى نافذة اللوحة مع الخيار المناسب. لحساب الشظايا الممكنة من كل بنية جليكانية، اختر الهيكل في القماش. ثم، تحت الأدوات والشظايا، اختر شظايا الحساب للهيكل الحالي.

إذا تم حساب شظايا لأكثر من بنية جليكانية واحدة، اذهب إلى عرض جدول الشظايا تحت تبويب الملخص لعرض جدول المقارنة. اختر الشظايا التي تطابق قائمة القمم لكل تركيب محتمل من الجليكان. انقر بزر الفأرة الأيمن واختر نسخ الشظايا إلى اللوحة من القائمة المنسدلة.

وأخيرا، في تبويب الأدوات، اذهب إلى Profiler ثم أضف التعليقات إلى القمم التي تحتوي على جميع الهياكل. ثم اختر الأدوات، التقارير، وأنشئ تقريرا عن التعليقات. أدى إزالة الملح عن طريق تبادل الأيونات إلى استعادة أفضل للجليكانات الأكبر، حيث شكلت هذه الهياكل الأكبر 31٪ من إجمالي الجليكانات مقارنة ب 21٪ لاستخراج PGC.

من بين الهياكل الجليكانية التي تم تحديدها، تم التعرف على جليكان واحد فقط من خلال عينة إزالة الملح من تبادل الأيونات. علاوة على ذلك، أدى إزالة الأملاح عن طريق تبادل الأيونات وإزالة البورات إلى أطياف ذات نسب إشارة إلى ضوضاء أعلى مقارنة بتلك الناتجة بعد إزالة الملح عن طريق استخراج الطور الصلب باستخدام PGC. أدت أوقات تفاعل النفاذية التي بلغت 30 و90 دقيقة إلى تحديد 33 قمة جليكان، بينما حدد تفاعل استمر خمس دقائق 31 قمة فقط.