استخراج الحمض النووي للبكتيريا الفطرية باستخدام ضرب الخرزة في مخزن مؤقت مخصص متبوعا بسير عمل NGS

تركز أبحاثنا التشخيصية على تحسين الكشف عن مقاومة الأدوية في مرض السل في بيئات محدودة الموارد ، مع التركيز على السرعة والبراغماتية. في تشخيص السل ، هناك فحوصات وراثية أكثر شمولا ، وحتى عدد من فحوصات النمط الظاهري السريع الجديدة ، وهناك دفعات متسقة لتقريب هذه الاختبارات من نقطة الرعاية. ولكن هناك عددا من الحواجز البراغماتية التي لا تزال قائمة.

لا تزال تحديات الموارد من الكواشف إلى البنية التحتية إلى الخدمات اللوجستية تشكل عوائق كبيرة. مع أي شيء يتجاوز التطور التقني لمقايسة Cepheid Xpert ، يكون توحيد البروتوكول أمرا صعبا في أماكن مختلفة. لذا ، فإن استخراج الحمض النووي MTB كما هو مفصل في هذا العمل هنا ، هو مثال رئيسي على ذلك.

هناك حاجة ماسة لتوسيع نطاق تشخيص السل القائم على التسلسل ، لكن العديد من المختبرات لا تزال تفتقر إلى طريقة موثوقة لاستخراج الحمض النووي عالي الجودة. هدفنا هو مشاركة طريقة بسيطة وعملية ومناسبة لإعداد نقاط الرعاية منخفضة الموارد. نقدم هنا بروتوكولا بسيطا منخفض التكلفة مصمما للاستخدام في الإعدادات محدودة الموارد.

تم التحقق من صحتها لتطبيقات NGS ، وهي متوافقة مع أنظمة معالجة السوائل الآلية. للبدء ، اجمع بين محلول كلوريد الصوديوم Tris hydrochloride buffer و Triton X 100 و EDTA لعمل المخزن المؤقت Triton. امزج عن طريق التحريك وأضف الماء عالي النقاء للوصول إلى الحجم النهائي البالغ 100 مل.

قم بتصفية تعقيم المخزن المؤقت قبل الاستخدام. بعد ذلك ، قم بإعداد 100 مل من المخزن المؤقت Tris-EDTA منخفض EDTA عن طريق الجمع بين مليلتر واحد من Tris-HCl ذو ضرس واحد و 20 ميكرولتر من 0.5 مولار EDTA. تخلط وتملأ بالماء فائق النقاء للوصول إلى الحجم النهائي البالغ 100 مل.

ثم تصفية تعقيم المخزن المؤقت. لتحضير أنابيب التحلل ، استخدم شفرة مشرط لقطع الجزء السفلي بعناية من أنبوب الغطاء اللولبي سعة 1.5 مل أسفل نقطة الانقلاب مباشرة. اقطع طرف الماصة P1000 واصنع إسفينا على شكل حرف V بالقرب من النهاية.

قم بربط الجزء السفلي المقطوع من أنبوب الغطاء اللولبي في طرف الماصة على شكل حرف V لتشكيل مغرفة. املأ حاوية معقمة بخرز سيليكات زركونيا 0.1 ملم. باستخدام المغرفة المحضرة ، انقل ما يقرب من 200 ملليغرام من الخرز إلى أنابيب ذات غطاء لولبي سعة 1.5 ملليلتر.

لتحضير ثقافة الخلايا البكتيرية ، انقل خمسة ملليلتر من ثقافة المتفطرة السلية إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي 15 مل. قم بالطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة 10 دقائق. استخدم الآن ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر لإزالة جميع المواد الطافية بعناية باستثناء ما يقرب من 500 ميكرولتر دون إزعاج الحبيبات.

استخدم ماصة P1000 لإزالة المادة الطافية المتبقية. أعد تعليق الحبيبات في 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت المخصص للتريتون، ثم اخلطها جيدا عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل. سخني العينة في حمام حراري جاف لمدة 30 دقيقة عند 95 درجة مئوية.

لتحضير البلغم ، انقل من واحد إلى خمسة ملليلتر من عينة البلغم إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مل. لإجراء تسييل ديثيوثريتول ، أضف أربعة مجلدات من ديثيوثريتول 10 ملليمولار إلى عينة البلغم ، ثم دوامة جيدا لمدة 30 ثانية. قم بالطرد المركزي للعينة بأقصى سرعة لمدة 10 دقائق.

ثم استخدم ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر للتخلص من جميع المواد الطافية باستثناء 500 ميكرولتر. قم بإزالة باقي المادة الطافية باستخدام ماصة P1000 دون إزعاج الحبيبات. أعد تعليق الحبيبات في 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت المخصص للتريتون.

لإجراء تسييل هيدروكسيد الصوديوم NALC ، أضف أربعة مجلدات من محلول هيدروكسيد الصوديوم NALC إلى عينة البلغم. دوامة الخليط لمدة 30 ثانية. ثم احتضن الأنبوب لمدة سبع دقائق في درجة حرارة الغرفة.

أضف الآن PBS حتى علامة 50 مل. قم بتدوير محتويات الأنبوب لخلطها جيدا ، ثم قم بالطرد المركزي للأنبوب بأقصى سرعة لمدة 10 دقائق. بعد الطرد المركزي ، باستخدام ماصة مصلية سعة 50 مل ، تخلص من المادة الطافية كما هو موضح سابقا.

ثم أعد تعليق الحبيبات في 350 ميكرولتر من مخزن مؤقت تريتون مخصص. أولا ، انقل 350 ميكرولتر من العينة المعطلة إلى أنبوب غطاء لولبي سعة 1.5 مليلتر يحتوي على 250 ميكرولتر من حبات سيليكات الزركونيا 0.1 ملليمتر. تغلب الخرزة على الحاللة بسرعة 6.5 متر في الثانية لمدة 45 ثانية مع دقيقتين من الراحة بين الدورات.

قم بطرد العينة بأقصى سرعة لمدة دقيقتين ، ثم انقل 150 ميكرولتر من المادة الطافية إلى أنبوب جديد مسمى. بعد ذلك ، قم بتنظيف الدوامة للحبات المغناطيسية التي تم مساواتها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، لإعادة تعليقها. نقل 180 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي إلى عينة الحمض النووي.

قم بضرب المعضلة لأعلى ولأسفل 10 مرات للخلط. بعد حضانة لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة ، ضع الأنبوب على رف مغناطيسي وانتظر دقيقتين حتى يمسح المحلول. ثم استخدم ماصة 200 ميكرولتر للتخلص من المادة الطافية.

مع بقاء الأنبوب على الرف المغناطيسي ، أضف 500 ميكرولتر من الإيثانول الطازج بنسبة 70٪ على طول الجدار المقابل ، وانتظر لمدة 30 ثانية. في نهاية الغسيل الأخير ، قم بإزالة الإيثانول المتبقي باستخدام ماصة 10 ميكرولتر وجففها في الهواء لمدة دقيقتين. بمجرد أن تصبح الخرز معتمة ، قم بإزالة الأنبوب من الرف المغناطيسي.

أعد التعليق في 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت EDTA Tris المنخفض. امزج عن طريق سحب العينة أو الدوامة للتأكد من أن جميع الخرزات في محلول قبل الحضانة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، ضع الأنبوب على رف مغناطيسي لمدة دقيقتين حتى يصبح صافيا.

ثم انقل أقل من 20 ميكرولتر من الحمض النووي المبذوب إلى أنبوب جديد مسمى لتجنب ترحيل الخرز. لتحديد الحمض النووي للبكتيريا الفطرية باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الذي يستهدف 99 نيوكليوتيد من البكتيريا الفطرية atpE ، قم بتجميع مزيج رئيسي من QPCR على الجليد. اضبط المزيج الرئيسي بناء على كمية العينات والمعايير، بما في ذلك زيادة بنسبة 10٪ لحساب فقدان سحب العينات.

قم بتشغيل التدوير الحراري بمعدل 95 درجة مئوية لمدة 60 ثانية ، متبوعا ب 35 دورة 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية بمعدل منحدر 2.11 درجة مئوية في الثانية. قم بتشغيل جميع العينات والمعايير وعناصر التحكم في ثلاث نسخ. هنا ، أسفرت مزارع المتفطرة السلية عن أعلى تركيزات الحمض النووي بين جميع الحالات التي تم اختبارها.

أظهرت عينات البلغم المسننة انخفاض تدريجيا في غلة الحمض النووي ، وزيادة التباين مع انخفاض المدخلات البكتيرية ، خاصة في مجموعة البكتيريا 10،000.