بروتوكولات الفحص التجريبية والكيمياء المناعية وتقنيات التصوير القائمة على الفحص المجهري للبنيوم مارغريتاسيوم

يركز بحثنا على دور جدار الخلية في الحفاظ على شكل الخلية والاستجابة للإجهاد الخارجي. نستخدم مجموعة من تقنيات الفحص المجهري الضوئي والمجهر بالليزر متحد البؤر لتصوير بنية جدار الخلية في الخلايا الحية والفحص المجهري الإلكتروني للتصوير عالي الدقة لجدران الخلايا.

يفتقر النقص الحالي إلى خطوط الخلايا المحولة للطحالب العقدية التي تعبر عن بروتينات فرعية محددة لتسليط الضوء على ديناميكيات جدار الخلية. يتطلب هذا بعد ذلك استخدام الأجسام المضادة ومجسات الفلورسنت الأخرى للدراسة. يستجيب جدار الخلية للبنيوم لأشكال مختلفة من الإجهاد اللاأحيائي والحيوي ، وهذا يؤدي إلى اللدونة المظهرية. لقد وجدنا أن بكتين جدار الخلية جزء مهم من هذه العملية. يوفر النمط الظاهري أحادي الخلية والقدرة على إجراء وضع العلامات على الخلايا الحية باستخدام Penium لعلماء الأحياء النباتية الفرصة للتعمق في بنية وتطور جدار الخلية.

[مدرب] للبدء ، قم بإزالة خمسة ملليلتر من مزارع الخلايا السائلة التي تنمو بنشاط من Penium margaritaceum. انقله إلى أنبوب طرد مركزي بلاستيكي سعة 15 ملليلتر ، ثم جهاز طرد مركزي. بعد سكب المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من WHM الطازج. قم بتأمين غطاء الأنبوب بإحكام وبهز الأنبوب بقوة لمدة 10 ثوان لإعادة تعليق الحبيبات وإزالة أي مادة بوليمرية خارج الخلية من سطح جدار الخلية. بعد الغسيل النهائي ، أعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من WHM الطازج ، ثم انقل 200 ميكرولتر من أجزاء من تعليق الخلية إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 ملليلتر. قم بالطرد المركزي لأنابيب الغطاء في جهاز الطرد المركزي الدقيق عند 1000 جم لمدة دقيقة واحدة ، ثم قم بشفط المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في 400 ميكرولتر من WHM الطازج. بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولترا من الجسم المضاد أحادي النسيلة المخفف إلى تعليق الخلية والدوامة جيدا. ثم لف الأنبوب بورق الألمنيوم واحتضنه على دوار المختبر لمدة 90 دقيقة. قم بالطرد المركزي للتعليق ، واستنشاق المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من WHM الطازج قبل الدوامة لمدة 10 ثوان. بعد الطرد المركزي النهائي ، أعد تعليق الحبيبات في 400 ميكرولتر من WHM وأضف ثمانية ميكرولترات من الماعز المضاد للفئران TRITC أو FITC. أخيرا ، أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من وسط النمو. قم بتغطية الأنبوب ولفه بورق الألمنيوم حتى يصبح جاهزا للتصوير. تمييع الخلايا المسماة بالجسم المضاد JIM5 عشرة أضعاف في WHM. أضف قطرة 50 ميكرولتر من تعليق الخلية المخفف على زلة الغطاء. احتضن الخلايا لمدة دقيقتين في الظلام للسماح بالالتصاق الخلية ، ثم قم بسحب ماصة ملليلتر واحد من WHM بعناية لشطف أي خلايا غير ملتصقة. أضف 30 ميكرولترا من WHM فوق الخلايا المرفقة. قم بتراكب القطرة ب 30 ميكرولتر من الاغاروز الدافئ بنسبة 4٪ في WHM واتركها تتصلب. بالنسبة للعينات الموجودة في طبق بتري ، أضف ما يكفي من WHM لتغطية الخلايا المضمنة في الاغاروز بالكامل. بالنسبة للخلايا الموجودة على زلة الغطاء، اقلب زلة الغطاء وضعها برفق فوق شريحة اكتئاب مملوءة ب WHM. قم بتركيب الخلايا المحضرة على مجهر الفلورسنت. قم بإعداد مصباح خارجي أو استخدم الإضاءة المدمجة في المجهر لدعم نمو الخلايا وحركتها. التقط الصور كل 10 إلى 30 دقيقة باستخدام مرشح TRITC الذي تم تعيينه لتتبع تمدد جدار الخلية. قم بإعداد أنبوب يحتوي على خمسة ملليلتر من مزارع الخلايا المغسولة التي يبلغ عمرها 10 إلى 14 يوما. بعد ذلك ، أضف حوالي 100 ميكرولتر من حبات الفلورسنت 0.75 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. ماصة ملليلتر واحد من WHM في الأنبوب ورجها بقوة لتعليق الخرز. الطرد المركزي الأنبوب عند 10,000 غرام لمدة ثلاث دقائق. أعد تعليق الحبيبات النهائية في 500 ميكرولتر من WHM. بعد ذلك ، قم بإدخال مخطط واحد من وسط WHM لكل بئر من صفيحة 12 بئرا. أضف مثبطات أو منظمات نمو لتحقيق التركيز المطلوب وقم بتدوير اللوحة برفق. أضف 10 ميكرولترات من محلول الخرزة ولفها برفق مرة أخرى للخلط ، ثم أضف 10 ميكرولترات من الخلايا المغسولة إلى كل بئر قبل الخلط. احتضن اللوحة لمدة 24 ساعة في الضوء. دون إزعاج اللوحة ، ضعها على مجهر مضان مقلوب مزود بمرشح FITC. ماصة مليتر واحد من معلق الخلية في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 4,000 جم لمدة دقيقة واحدة. بعد التخلص من المادة الطافية ، اغمر الأنبوب الذي يحتوي على الحبيبات في النيتروجين السائل أو قم بتجميد درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر. أعد تعليق الحبيبات المذابة في 20 ميكرولتر من WHM. ضع قطرة من تعليق الخلية الكثيفة على زلة غطاء مقاس 45 × 50 ملم. ضع زلة غطاء ثانية فوق القطرة لعمل شطيرة. اضغط باستمرار على الساندويتش لمدة 30 ثانية لتمزيق الخلايا. افصل زلات الغطاء بعناية. أضف WHM فوق زلات الغطاء لغسل الخلايا الممزقة في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مليلتر وجهاز طرد مركزي. افحص الحبيبات البيضاء أو الخضراء قليلا بعد التخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات التي تحتوي على جدران الخلايا في ماء منزوع الأيونات. بعد تمزق الخلية والطرد المركزي ، أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات قبل نقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل. بعد ذلك ، قم بإرفاق شريط الكربون على سطح كعب كامبريدج. ماصة خمس قطرات ميكرولتر من تعليق جدار الخلية المعلق على شريط الكربون. استخدم هدف البلاديوم لرش كعب الروتين لمدة 50 ثانية بعد تركه يجف طوال الليل. راقب الخلايا عند خمسة كيلو فولت ، مع وضع حجم بقعة مناسب على بعد 10 سم من كاشف الإلكترون الثانوي. كشف وضع العلامات على جدار الخلية ل P. margaritaceum بالأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة للبكتين عن شبكة من ألياف الكالسيوم المعقدة التي تشكل نمطا شبكيا غير منتظم. تم ترسيب البكتين في مركز الخلية أو البرزخ ، مما دفع البكتين القديم نحو القطبين. أظهرت ملصقات JIM7 أن البكتين عالي الأسترة الميثيل قد تم إفرازه في البداية في نطاق ضيق عند البرزخ. تم اكتشاف بوليمرات أخرى في جدار الخلية ، مثل بروتين أرابينوجالاكتان ، باستخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة JIM13. تم إفراز كميات كبيرة من المواد البوليمرية خارج الخلية خارج جدار الخلية ، مما يتيح الانزلاق وتراكم الخلايا. سمحت تقنيات وضع العلامات بدراسات جدار الخلية الكمية والتوسع ، ودمج مناهج التصوير التنموي. كشفت الدراسات الهيكلية المترابطة أن شبكة البكتين النموذجية تتكون من شبكة من الألياف تنتهي خارجيا في إسقاطات مميزة. أدى العلاج بتركيزات عالية من الكالسيوم إلى تحويل شبكة البكتين إلى رواسب غير منتظمة ، كما لوحظ في الخلايا المسماة JIM5. عندما تم فحص جدران الخلايا المعالجة بالكالسيوم تحت المجهر الإلكتروني الماسح ، لوحظ هيكل البكتين غير المنظم بالتفصيل.