إعداد أنسجة المخ الرئيسيات غير البشرية لمرحلة ما قبل تضمين المناعية والمجهر الإلكتروني

الهدف العام من هذه التجربة هو الحصول على صبغ مناعي موثوق قبل التضمين لأنسجة دماغ غير بشرية مخصصة للمجهر الإلكتروني. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال التشريح العصبي، مثل معدل حدوث المشابك العصبية لتزويد عصبي معين في بنية دماغية دقيقة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها طريقة سهلة ومنخفضة التكلفة لوسم تزويدات عصبية محددة بشكل مناسب للمجهر الإلكتروني.

ابدأ بنقل مقاطع بسمك 50 ميكرون من دماغ رئيسيات غير بشرية مثبت بالأكرولين تحتوي على المنطقة المراد دراستها إلى طبق ذي 12 بئرًا يحتوي على PBS. اغسل المقاطع الطافية بحرية ثلاث مرات في PBS لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم حضن المقاطع في محلول بورهيدريد الصوديوم المُحضّر حديثًا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. رج الطبق بلطف بدون غطاء.

بمجرد انقضاء 30 دقيقة، يتم سحب بوروهيدريد الصوديوم وإضافة PBS إلى كل بئر. تُوضع اللوحة على هزاز وتُرج بقوة لمدة 10 دقائق. تُكرر عملية الغسل مرتين إضافيتين أو حتى يختفي غاز التفاعل تماماً.

قم بحجب المقاطع عن طريق تحضينها في محلول مكون من 2% normal serum و 0.5% cold fish gelatin مخفف في PBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع الهز اللطيف. وبمجرد انقضاء وقت التحضين، حضّن المقاطع في محلول الأجسام المضادة الأولية مع الهز اللطيف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. وفي اليوم التالي، وبعد غسل المقاطع كما سبق، حضّن المقاطع في محلول الأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعة ونصف في درجة حرارة الغرفة مع الهز اللطيف.

بعد غسل المقاطع كما سبق، تُحضن في محلول avidin-biotin-peroxidase أو محلول ABC لمدة ساعة واحدة مع التحريك المستمر. بعد ذلك، يتم تحضير محلول طازج من 0.05% 3, 3'Diaminobenzidine مع 0.005% hydrogen peroxide مخففاً في TBS. وبعد الغسل، تُحضن المقاطع في محلول DAB لمدة تتراوح من ثلاث إلى سبع دقائق مع التحريك اللطيف.

بمجرد أن يتطور الراسب البني ليصل إلى اللون المطلوب، أوقف التفاعل عن طريق الغسل السريع مرتين في محلول TBS بارد، ثم من خلال سلسلة من عمليات الغسل الموقوتة بمحلولي TBS وPB. انقل الطبق الذي يحتوي على المقاطع المصبوغة بـ DAB إلى غطاء التهوية. انقل المقاطع إلى طبق سداسي الفجوات مملوء بمحلول PB، وقم بتسطيح المقاطع تماماً عن طريق سحب محلول PB من الطبق بعناية باستخدام الماصة، ثم أضف محلول رابع أكسيد الأوزميوم قطرة بقطرة لتجنب تحريك المقاطع المسطحة.

قم بتغطية الطبق بورق ألومنيوم لحماية المقاطع من الضوء، ثم حضّنها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة دون تحريك. وأثناء عملية التناضح (osmification)، قم بتحضير راتنج إيبوكسي طارد للماء عن طريق إضافة كميات مناسبة من كل مكون من مكونات خليط راتنج الإيبوكسي إلى كوب بلاستيكي كبير. قلّب الخليط باستخدام عود خشبي أو ماصة بلاستيكية حتى يتم الحصول على لون بني متجانس، ثم انقل كميات متساوية من الراتنج إلى أكواب ألومنيوم ذات حجم مناسب لعدد المقاطع المراد معالجتها واتركها لترتاح.

بمجرد انتهاء فترة التثبيت بالأوزميوم، تُغسل المقاطع ثلاث مرات في محلول PB لمدة 10 دقائق مع التحريك الهزاز بسرعة منخفضة. بعد الغسيل، يتم تجفيف المقاطع في سلسلة من الإيثانول المتدرج التالية لمدة دقيقتين لكل تركيز. بعد ذلك، تُنقل المقاطع إلى قنينات زجاجية مملوءة بأكسيد البروبيلين، وتُحضن في أكسيد البروبيلين ثلاث مرات لمدة دقيقتين في كل مرة لإتمام عملية التجفيف.

بعد ذلك، انقل المقاطع بعناية، واحداً تلو الآخر، إلى الكؤوس الألومنيوم، مع تجنب ملامسة الهواء قدر الإمكان. قم بتثبيت المقاطع بشكل مسطح في راتنج الإيبوكسي الطارد للماء الذي تم خلطه مسبقاً، واتركها تحضن طوال الليل تحت غطاء التهوية في درجة حرارة الغرفة. وفي اليوم التالي، غطِّ الشرائح الزجاجية وأغطية الشرائح البلاستيكية بالزيت المعدني، ثم قم بتليين الراتنج عن طريق تحضين كؤوس الألومنيوم عند 60 degrees Celsius لمدة تتراوح من 12 إلى 15 دقيقة كحد أقصى.

قم بتسوية المقاطع بعناية على الجانب المدهون من الشريحة الزجاجية. ضع غطاء الشريحة المدهون وادفع أي هواء متبقٍ للخارج بعناية. قم بحضن الشرائح عند 60 °C لمدة 48 ساعة.

بعد مرور 48 ساعة، قم بإزالة غطاء الشريحة البلاستيكي، مع ترك المقطع مغلفاً بالراتنج. ابدأ باستخدام المنظار لتحديد المنطقة المراد دراستها، ثم استخدم مشرطاً لقص قطعة نسيج مربعة صغيرة بمساحة تقريبية تبلغ 1 mm² . بعد ذلك، قم ببرد طرف كتلة الراتنج ثم الصق قطعة النسيج المربعة عليها.

بعد التجفيف، ضع كتلة الراتنج في منصة الميكروتوم الفائق (ultramicrotome) في الوضع الرأسي، واستخدم شفرة حلاقة حادة لقص كل جانب من جوانب كتلة الراتنج تدريجياً لتشكيل شبه منحرف ذي جوانب ملساء. بعد ذلك، ضع المنصة في وضعها الأفقي وقم بتدوير الكتلة حتى يصبح الجانب الأطول من شبه المنحرف موجهاً لأسفل. ضع أداة تشذيب ماسية أو سكيناً زجاجياً في المكان المخصص.

اضبط جهاز الميكروتوم الفائق (ultramicrotome) لقطع مقاطع بسماكة 300 micron وبسرعة 1 millimeter في الثانية. اضبط السكين لتكون موازية عمودياً للقطعة الرباعية وبزاوية أفقية صغيرة جداً تبلغ درجة واحدة تقريباً، ثم قم بتسوية سطح القطعة الرباعية حتى يبدأ ظهور النسيج. الآن، انتقل إلى استخدام سكين ماسية بزاوية 45 درجة مجهزة بقارب مملوء بالماء المقطر لقطع مقاطع بسماكة 80 micron.

قم بتنعيم المقاطع عن طريق تمرير قطعة من ورق ماص مغموسة في xylene فوقها دون لمس سطح الماء، واجمع المقاطع المتسلسلة على شبكات نحاسية عارية ذات مسامية 150 mesh. ضع الشبكات في صندوق تخزين الشبكات، ثم حضّر محلولاً بنسبة واحد إلى واحد من محلول lead citrate المخزون والماء المقطر، وقم بترشيحه باستخدام مرشح سرنجة بمسامية 0.2 micron. غطِّ القارورة بورق ألومنيوم لحمايتها من الضوء.

ضع كل شبكة على قطرة من محلول سترات الرصاص المخفف، بحيث يكون المقطع ملامساً للمحلول. بعد ذلك، استخدم ملقطاً صغيراً للإمساك بالشبكة وشطفها جيداً في دورقين يحتويان على ماء مقطر. قم بإزالة الماء الزائد برفق باستخدام ورق امتصاص، ثم ضع الشبكات في صندوق الشبكات. بعد مرور 30 دقيقة، يمكن فحص المقاطع باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ.

تُظهر هذه الصورة بالمجهر الإلكتروني للكرة الشاحبة الداخلية في قرد السنجاب مادة محفوظة جيداً بعد التروية عبر القلب باستخدام الأكرولين وPFA في تقنية الديامينوبنزيدين المناعية البيروكسيدازية. وكما يتضح هنا، تسمح هذه الإجراءات برؤية غمد الميالين لمحور عصبي كبير، والذي يشير إليه رأس السهم. وتوضح هذه الصورة بالمجهر الإلكتروني للكرة الشاحبة الخارجية إمكانية تحديد المقاطع التشجيرية، المشار إليها بالحرف d، والمحاور العصبية الصغيرة غير الميالينية، المشار إليها بالحرف a، وتوسعيات المحاور العصبية، والمشار إليها بالرمز av، بسهولة.

توضح الأسهم مثالاً لتوسع محوري (axon varicosity) يشكل اتصالاً مشبكياً متماثلاً مع المقطع الشجري. يمكن التعرف بسهولة على العناصر المصبوغة مناعياً من خلال السيتوبلازم أو السيتوبلازم المحوري الممتلئ برواسب DAB الكثيفة إلكترونياً. هنا، تستقبل زائدة شجيرية مصبوغة مناعياً لإنزيم choline acetyltransferase في GPi اتصالاً مشبكياً من توسع محوري غير مصبوغ.

تظهر هذه الصورة المجهرية الإلكترونية محوراً عصبياً مكسواً بالنخاعين في GPe مع غمد نخاعين سليم نسبياً، حيث تم وسم السيتوبلازم المحوري مناعياً لإنزيم tyrosine hydroxylase. ويظهر هذا المثال توسعاً محورياً في GPi موسوماً مناعياً لناقل serotonin transporter، والذي يشكل اتصالاً مشبكياً متماثلاً مع تغصن شجيري. وفي هذا المثال، يحدد راسب DAB الغشاء البلازمي والسطح الخارجي للعضيات.

لوحظ توسع المحور العصبي الموضح هنا في GPe وتم وسمه مناعياً باستخدام tyrosine hydroxylase. يمثل هذا مثالاً لترسب DAB الذي يملأ السيتوبلازم المحوري بالكامل، حيث تكون الحويصلات التشابكية مرئية ولكن يصعب تحديد معالمها بدقة. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى، مثل الكيمياء النسيجية المناعية المزدوجة قبل الطمر، للإجابة على أسئلة إضافية مثل التوطين المشترك للبروتينات أو المستقبلات على المستوى التشابكي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير الكيمياء النسيجية المناعية قبل التضمين لأنسجة دماغ غير الرئيسيات، والمضي قدماً في التضمين في راتنج الإيبوكسي، والتقطيع الفائق للمنطقة المستهدفة إلى مقاطع بسمك 80 ميكرومتر تكون مناسبة للمجهر الإلكتروني.