إعداد أنسجة المخ الرئيسيات غير البشرية لمرحلة ما قبل تضمين المناعية والمجهر الإلكتروني
أبريل 3, 2017
هنا، ونحن نقدم ل، منخفضة التكلفة سهلة، والوقت كفاءة بروتوكول لإصلاح أنسجة المخ كيميائيا الرئيسيات مع تثبيتي الأكرولين، مما يسمح للحفاظ على المدى الطويل والتي تتوافق مع ما قبل التضمين المناعية للانتقال المجهر الإلكتروني.
الهدف العام من هذه التجربة هو الحصول على تلطيخ مناعي موثوق به لأنسجة المخ غير الرئيسيات للفحص المجهري الإلكتروني. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التشريح العصبي ، مثل الحدوث المشبكي لتعصيب معين في بنية دماغية دقيقة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها طريقة سهلة ومنخفضة التكلفة لتسمية أعصاب معينة مناسبة للفحص المجهري الإلكتروني.
ابدأ بنقل أقسام بسمك 50 ميكرون من دماغ الرئيسيات غير البشري الثابت الذي يحتوي على منطقة الاهتمام إلى صفيحة 12 بئر تحتوي على PBS. اغسل الأقسام العائمة الحرة ثلاث مرات في PBS لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم احتضن الأقسام في محلول بوروهيدريد الصوديوم المحضر حديثا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. صخور بلطف بدون غطاء.
بمجرد انقضاء 30 دقيقة ، قم بشفط بوروهيدريد الصوديوم وأضف PBS إلى كل بئر. ضع الطبق على كرسي هزاز ورجه بقوة لمدة 10 دقائق. كرر الغسيل مرتين أخريين أو حتى لا يتبقى أي من غاز التفاعل.
قم بسد الأقسام عن طريق احتضانها في محلول من مصل 2٪ عادي و 0.5٪ جيلاتين السمك البارد المخفف في PBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع هزاز لطيف. بمجرد انقضاء وقت الحضانة ، قم باحتضان الأقسام في محلول الجسم المضاد الأولي مع هزاز لطيف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. في اليوم التالي ، بعد غسل الأقسام كما كان من قبل ، احتضان الأقسام في محلول الأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعة ونصف في درجة حرارة الغرفة مع هزاز لطيف.
بعد غسل الأقسام كما كان من قبل ، احتضن في محلول أفيدين-بيوتين-بيروكسيداز أو ABC لمدة ساعة واحدة مع الهزاز. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول جديد بنسبة 0.05٪ 3 ، 3'ديامينوبنزيدين مع 0.005٪ بيروكسيد الهيدروجين المخفف في TBS. بعد الغسيل ، احتضان الأقسام في محلول DAB لمدة ثلاث إلى سبع دقائق مع هزاز لطيف.
بمجرد أن يتطور الراسب البني إلى اللون المطلوب ، أوقف التفاعل عن طريق الغسيل السريع مرتين في TBS البارد ، ثم من خلال سلسلة من غسلات TBS و PB الموقوتة. انقل اللوحة التي تحتوي على الأقسام الملطخة ب DAB إلى غطاء التهوية. انقل الأقسام إلى صفيحة من ستة آبار مملوءة ب PB وقم بتسطيح الأقسام تماما عن طريق سحب PB بعناية من اللوحة ، ثم أضف محلول رابع أكسيد الأوزميوم قطرة قطرة لتجنب إزعاج الأقسام المسطحة.
قم بتغطية اللوحة بورق الألمنيوم لحماية الأقسام من الضوء واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة دون تحريض. أثناء التناضح ، قم بإعداد راتنجات الايبوكسي الطاردة للماء عن طريق إضافة كميات مناسبة من كل مكون من مكونات مزيج راتنجات الايبوكسي إلى كوب بلاستيكي كبير. قلبي بعصا خشبية أو ماصة بلاستيكية حتى يتم الحصول على لون بني متجانس ، ثم انقل كميات متساوية من الراتنج إلى أكواب من الألومنيوم بحجم مناسب لعدد الأقسام المراد معالجتها واتركها ترتاح.
بمجرد انقضاء فترة التذبذب ، اغسل الأقسام ثلاث مرات في PB لمدة 10 دقائق مع هزاز منخفض السرعة. بعد الغسيل ، قم بتجفيف الأقسام في السلسلة التالية من الإيثانول المتدرج لمدة دقيقتين لكل منهما. بعد ذلك ، انقل الأقسام إلى قوارير زجاجية مملوءة بأكسيد البروبيلين واحتضانها في أكسيد البروبيلين ثلاث مرات لمدة دقيقتين لكل منهما لإكمال عملية الجفاف.
ثم انقل الأقسام بعناية ، واحدة تلو الأخرى ، إلى أكواب الألمنيوم ، وتجنب ملامسة الهواء قدر الإمكان. قم بتضمين الأقسام بشكل مسطح في راتنجات الايبوكسي المختلطة مسبقا واحتضانها طوال الليل تحت غطاء التهوية في درجة حرارة الغرفة. في اليوم التالي ، قم بتغطية الشرائح الزجاجية والغطاء البلاستيكي بالزيت المعدني ، ثم قم بتليين الراتنج عن طريق احتضان أكواب الألمنيوم عند 60 درجة مئوية لمدة 12 إلى 15 دقيقة على الالأكثر
قمبتسطيح الأقسام الموجودة على الجانب المدهون من الشريحة الزجاجية بعناية. ضع زلة الغطاء المدهونة بالزبدة وادفع أي هواء متبقي للخارج بحذر. احتضن الشرائح عند 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
بعد 48 ساعة ، قم بإزالة زلة الغطاء البلاستيكي ، واترك القسم مغطى بالراتنج. ابدأ باستخدام المناظير لتحديد منطقة الاهتمام ثم استخدم مشرطا لقطع قطعة صغيرة رباعية الزوايا من الأنسجة يبلغ حجمها حوالي مليلتر واحد مربع. بعد ذلك ، قم بحفظ طرف كتلة الراتنج ثم قم بلصق قطعة الأنسجة رباعية الزوايا عليها.
بعد التجفيف ، ضع كتلة الراتنج في سطح الميكروتوم الفائق في الوضع الرأسي واستخدم شفرة حلاقة حادة لقطع كل جانب من جوانب الراتنج تدريجيا لتشكيل شبه منحرف بجوانب ناعمة. بعد ذلك ، ضع السطح في موضعه الأفقي وقم بتدوير الكتلة حتى يتجه أطول جانب من شبه المنحرف لأسفل. ضع أداة تشذيب ماسية أو سكين زجاجي في مساحة مخصصة.
اضبط الميكروتوم الفائق لقطع أقسام 300 ميكرون بمعدل ملليمتر واحد في الثانية. اضبط السكين ليكون موازيا عموديا للقطعة الرباعية الزوايا ولعرض زاوية أفقية صغيرة جدا تبلغ درجة واحدة تقريبا وقم بقص سطح القطعة الرباعية الزوايا حتى يبدأ النسيج في الظهور. الآن ، قم بالتبديل إلى سكين ماسي بزاوية 45 درجة مزودا بقارب مملوء بالماء المقطر لقطع أقسام بسمك 80 ميكرون.
قمبتنعيم الأقسام عن طريق تجاوزها بقطعة من ورق الامتصاص مائلة بالزيلين دون لمس سطح الماء ، وجمع الأقسام التسلسلية على 150 شبكة نحاسية عارية. ضع الشبكات في صندوق تخزين شبكي ثم قم بإعداد محلول واحد لواحد من محلول مخزون سترات الرصاص والماء المقطر والفلتر من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرون. غطي القارورة بورق الألمنيوم لحمايتها من الضوء.
ضع كل شبكة على قطرة من محلول سترات الرصاص المخفف ، مع ملامسة القسم للمحلول ثم استخدم ملاقط صغير لتثبيت الشبكة وشطفها جيدا في كوبين يحتويان على الماء المقطر. قم بإزالة الماء الزائد برفق باستخدام ورق الامتصاص وضع الشبكات في صندوق شبكي. بعد 30 دقيقة ، يمكن فحص الأقسام عن طريق المجهر الإلكتروني للإرسال.
يظهر هذا الرسم المجهري الإلكتروني لقرد السنجاب الداخلي للكرة الجحوبة مادة محفوظة جيدا بعد نضح الأكرولين PFA عبر القلب في تقنية إيمونوبيروكسيديز ديامينوبنزيدين. كما هو موضح هناك ، يسمح الإجراء برؤية غمد المايلين لمحور عصبي كبير ، يشار إليه برأس السهم. يوضح هذا الرسم المجهري الإلكتروني للكرة الشاحبة الخارجية الملامح التغصنية ، المشار إليها بالحرف d ، ويمكن بسهولة التعرف على المحاور الصغيرة غير الميالينية ، المشار إليها ب a ، والدوالي المحورية ، المسماة av.
تظهر الأسهم مثالا على دوالي محورية تؤسس اتصالا متشابها متماثلا مع المظهر التغصني. يمكن التعرف بسهولة على العناصر ذات العلامات المناعية من خلال السيتوبلازم أو الأكسوبلازم المملوء براسب DAB كثيف الإلكترون. هنا ، يتلقى التغصنات المناعية لأسيتيل ترانسفيراز الكولين في GPi اتصالا متشابكا من دوالي محور عصبي غير مسمى.
يظهر هذا الرسم المجهري الإلكتروني محورا عصبيا نخاعا في GPe مع غمد مايلين سليم نسبيا تم تصنيف أكسوبلازم عليه مناعة لهيدروكسيلاز التيروزين. يوضح هذا المثال دوالي محورية في GPi المناعية لناقل السيروتونين الذي يؤسس اتصالا متشاككا متماثلا مع التغصنات. في هذا المثال ، يبطن راسب DAB غشاء البلازما والسطح الخارجي للعضيات.
لوحظت الدوالي المحورية الموضحة هنا في GPe وتم تصنيفها مناعية لهيدروكسيلاز التيروزين. يمثل هذا مثالا على ترسيب DAB الذي يملأ الأكسوبلازم بالكامل ، مع ظهور الحويصلات المشبكية ولكن يصعب تحديدها. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل التضمين المسبق للكيمياء المناعية المزدوجة للإجابة على أسئلة إضافية مثل تحديد موقع البروتينات أو المستقبلات على المستوى المشبكي.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير الكيمياء المناعية المسبق للتضمين لأنسجة المخ غير الرئيسيات ، والمضي قدما في التضمين في راتنجات الايبوكسي ، وتقطيع منطقة الاهتمام إلى أقسام بسمك 80 ميكرومتر مناسبة للفحص المجهري الإلكتروني.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولًا لتثبيت الأنسجة الدماغية للرئيسيات كيميائيًا باستخدام مثبت الأكرولين، مما يسمح بالحفظ طويل الأمد المتوافق مع التلطيخ المناعي قبل التضمين لفحص المجاهر الإلكترونية. تم تصميم الطريقة لتكون سهلة ومنخفضة التكلفة وفعالة من حيث الوقت.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- تشريح الأعصاب
- المجهر الإلكتروني
الخلفية
- التلطيخ المناعي الموثوق قبل التضمين ضروري لدراسة أنسجة الدماغ.
- فهم تكرار المشابك في هياكل دماغية محددة هو محور بحث رئيسي.
- يوفر تثبيت الأكرولين مزايا في حفظ الأنسجة.
- هذه الطريقة مناسبة بشكل خاص لدراسات دماغ الرئيسيات غير البشرية.
هدف الدراسة
- لتطوير بروتوكول لتثبيت فعال لأنسجة الدماغ.
- لتيسير التلطيخ المناعي لفحص المجاهر الإلكترونية.
- لتعزيز دراسة الهياكل المشبكية في تشريح الأعصاب.
الطرق المستخدمة
- نقل مقاطع بسمك 50 ميكرون من الأنسجة الدماغية المثبتة بالأكرولين إلى PBS.
- غسل الشرائح في PBS لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- تخمير الشرائح في محلول بوروهيدريد الصوديوم لمدة 30 دقيقة.
- هز الشرائح بلطف دون غطاء أثناء التخمير.
النتائج الرئيسية
- يسمح البروتوكول بتمييز فعال للاتصالات العصبية المحددة.
- يتم تحقيق الحفظ طويل الأمد لأنسجة الدماغ.
- تم تأكيد التوافق مع الفحص بالمجاهر الإلكترونية.
- الطريقة فعالة من حيث التكلفة والوقت.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول نهجًا موثوقًا لتثبيت أنسجة الدماغ.
- يدعم الدراسات المتقدمة في تشريح الأعصاب والهياكل المشبكية.
- يمكن للبحوث المستقبلية الاستفادة من هذه الطريقة في تطبيقات مختلفة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This protocol enables cost-effective preservation of non-human primate brain tissue for ultrastructural analysis, supporting target validation in neuroscience drug discovery. By combining chemical fixation with pre-embedding immunohistochemistry, it provides a scalable approach to study synaptic connectivity and neuronal morphology relevant to neuropsychiatric and neurodegenerative disease models. The method reduces reliance on expensive cryo-fixation while maintaining compatibility with electron microscopy, facilitating mechanistic de-risking in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through ultrastructural visualization of synaptic contacts in defined brain circuits.
- Operational Value: Supports biological de-risking by confirming target engagement and neuronal pathway integrity at the ultrastructural level.
- Predictive Value: Enhances confidence in target selection by providing direct evidence of neuroanatomical specificity and connectivity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by preserving antigenicity and ultrastructure for correlative light and electron microscopy.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation for reproducible immunohistochemical labeling, reducing variability in target validation assays.
- Scalability: Enables platform reuse across multiple brain regions and antibody panels due to low cost and minimal equipment requirements.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease-relevant system integrity by preserving neuronal ultrastructure in non-human primate models, aligning with translational biomarker studies.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by providing consistent ultrastructural readouts across study phases.
- Risk Mitigation: Supports risk-adjusted advancement decisions by enabling detailed morphological assessment of potential off-target effects on neural circuitry.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing to preclinical validation, enabling ultrastructural confirmation of mechanistic hypotheses in neuropsychiatric and neurodegenerative disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing synaptic incidence of specific innervations in precise brain structures.
- Screening: Enables assay readiness through standardized, reproducible pre-embedding immunostaining suitable for quantitative electron microscopy analysis.
- Analytics: Generates quantitative ultrastructural measurements (e.g., synaptic density, axon varicosity frequency) that help teams compare experimental conditions and assess target specificity.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by preserving disease-relevant neuronal architecture in primate models, supporting biomarker alignment studies.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable histology platform rather than a single-use technique, adaptable across multiple targets and brain regions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence through direct visualization of target-specific synaptic connections, reducing mechanistic ambiguity in neuroanatomy.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via well-defined chemical fixation and immunostaining steps, minimizing inter-lab variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of ultrastructural off-target effects, reducing late-stage biological risk in CNS drug development.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization by delivering ultrastructural data that informs target validation and lead optimization strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, immunohistochemistry, and electron microscopy sample preparation.
- Needs access to standard laboratory equipment including centrifuges, incubators, ultramicrotomes, and transmission electron microscopes.
- Demands cross-team standardization between histology, imaging, and data analysis groups to ensure consistent sectioning, staining, and quantification.
- Involves adaptation considerations for different brain regions, antibody penetration, and antigen retrieval efficiency across species and fixation conditions.
- Practical limitations include longer processing times compared to frozen sections and the need for optimization of antibody concentrations and DAB development times to avoid over-staining.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:43
Pre-embedding Immunohistochemistry
3:11
Osmification and Embedding for Electron Microscopy Observation
6:23
Sample Preparation for Ultrathin Sectioning and Observation Using a Transmission Electron Microscope
9:05
Results: Immunolabeling of the Squirrel Monkey Globus Pallidus for ChAT, SERT and TH
11:08
Conclusion
