معالجة وتحليل العمليات المعتمدة على دورة الخلية في الخميرة الناشئة

ندرس كيف تنقل الخلايا المنقسمة كروموسوماتها بأمانة أثناء الانقسام الانقسامي، مع التركيز على الآلات الجزيئية والآليات التي تضمن فصل الكروموسومات بدقة. نقوم بمزامنة الخلايا لدراسة العمليات الجزيئية التي تتغير مع دورة الخلية. بدون هذه الطرق، ستكون التغييرات الرئيسية مخفية في مجموعة خلايا غير متزامنة.

مقارنة بطرق التزامن الأخرى، يوفر إيقاف عامل ألفا في طفرات BAR1 توقفا أنظف وقابلا للعكس من G1، مما يسمح لنا بتتبع تقدم زراعة الخميرة بالكامل بشكل متزامن خلال الدورة. يكشف عملنا عن تحديد مواقع البروتين الديناميكي وتغيرات نشاطه طوال دورة الخلية، مما يسلط الضوء على العمليات الانقسامية الرئيسية مثل فصل الكروموسومات وصيانة المغازل. للبدء، قم بتلقيح الخميرة في 25 ملليلتر من وسط YPAD، واحتضن الليلة لتصل إلى كثافة بصرية تبلغ 600 نانومتر بين 0.5 و2.0.

قم بتخفيف خلايا الخميرة إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر من 0.5. أضف عامل ألفا إلى الزراعة للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ ميكروغرام واحد لكل ملليلتر. بعد 2.5 إلى 3.5 ساعة من إضافة عامل ألفا، عد نسبة الخلايا غير المتبرعمة تحت المجهر لتقييم توقف الخلية.

ثم، قم بتدوير الثقافة في جهاز طرد مركزي بقوة 3,000 جرام لمدة ثلاث إلى خمس دقائق عند 23 درجة مئوية. اسكب الفائق بحذر لإزالة عامل الألفا. أعد تعليق حبيبات الخلية في 25 ملليلتر من YPAD تحتوي على 1٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد لغسل الخلايا.

انقل حبيبة الخلية إلى أنبوب جديد وكرر الغسولات مرتين إضافيتين ليصبح المجموع ثلاث غسولات لإزالة أي عامل ألفا متبق. بعد ذلك، أضف YPAD إلى الخلايا المغسولة ليصل الحجم النهائي إلى 25 ملليتر، ثم انقل التعليق إلى قارورة جديدة للحضانة أو الاستخدام الإضافي. اجمع عينة نقطة الصفر مباشرة بعد الإطلاق وقم بتثبيت العينة.

بعد 60 دقيقة من الإفراز، قم بتقييم التزامن بين الخلايا تحت المجهر الضوئي. إذا رغبت، أضف عامل ألفا مرة أخرى بعد 60 دقيقة من الإفراج إلى تركيز نهائي يبلغ ميكروغرام واحد لكل ملليلتر لمنع التقدم إلى دورة الخلية التالية. استمر في جمع عينات النقاط الزمنية كل 15 دقيقة حتى 180 دقيقة أو لأطول فترة احتاج.

لتثبيت خلايا الخميرة، قم بجهاز الطرد المركزي بكمية مليلتر واحد من الزراعة لمدة دقيقة واحدة بأقصى سرعة. استنشق الفائق بالكامل. ثم أعد تعليق الحبيبة في 500 ميكرولتر من محلول التثبيت وحضن القرص عند 23 درجة مئوية لمدة دقيقتين إلى 15 دقيقة.

بعد طرد الخلايا الثابتة، استنشق المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبة في 500 ميكرولتر من حاجز فوسفات البوتاسيوم بطول 0.1 مول، عند درجة حموضة 6.4. قبل التصوير، قم بعمل الطرد المركزي على الخلايا الثابتة عند 23 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة بأقصى سرعة. بمجرد استنشاق المادة الفائقة، أعد تعليق الحبيبات في 10 إلى 100 ميكرولتر من ترايتون، DAPI، ومحلول سوربيتول.

تضع حوالي 0.8 ميكرولتر من تعليق الخلية الملونة مباشرة على مركز غطاء نظيف. استخدم رأس الماصة لتوزيع القطرة بلطف في منطقة دائرية بحجم حوالي سنتيمتر مربع واحد. ضع غطاء الغطاء على شريحة مجهرية.

باستخدام كيموايب، اضغط بلطف حول حواف الغطاء لتوزيع العينة بشكل متساو. ثم أغلقي حواف غطاء الغطاء بطلاء الأظافر لتثبيت العينة. خذ الشريحة المحضرة إلى مجهر مزود بتكبير 60 مرة، وهدف غمر زيت بفتحة عدسة رقمية 1.42، ومجموعة ليزر ومرشح أحمر وأخضر وأزرق وبعيد أحمر.

ركز المجهر على خلايا الخميرة الملتصقة بطبقة الغطاء. بمجرد التركيز، ضبط إعدادات التعريض لكل قناة فلورية لتحقيق نسبة إشارة إلى ضوضاء لا تقل عن ثلاثة إلى واحد. قم بضبط إعدادات الاقتناء لجمع 14 إلى 20 صورة مكدس z-stack مع كل شريحة متباعدة بمقدار 0.2 ميكرومتر، مع تغطية عمق z إجمالي يتراوح بين اثنين إلى أربعة ميكرومتر.

على المجاهر المزودة بوحدات معالجة لاحقة، اختر خيارات فك الالتفاف والإسقاط السريع لكل صورة z-stack. احصل على مجموعات z من العينة، مع التقاط صور كافية لتسجيل حوالي 100 إلى 200 خلية خميرة لكل حالة أو نقطة زمنية تجريبية. للتحليل، افتح الصور المعروضة في برنامج ImageJ.

قم بضبط السطوع والتباين لكل قناة فلورية لتعزيز الرؤية. لتحليل تقدم دورة الخلية، قم بعدد 100 خلية لكل نقطة زمنية وصنفها على أنها تحتوي على نواة أو نواتين. لحساب نسبة الخلايا التي تظهر نقطة Stu2-GFP، قم بتوحيد إعدادات سطوع القناة الخضراء عبر جميع الصور.

يعد الخلايا التي تظهر نقاط Stu2-GFP التي تتواجد مع Spc110-mCherry كخلايا إيجابية لتحديد موقع الكينيتوكور. بعد ذلك، لقياس شدة النقاط البروتينية، استخدم أداة الاختيار الحر لتحديد المنطقة المحيطة بالإشارة. أضف الاختيار إلى مدير منطقة الاهتمام بالضغط على T أو اختيار الخيار من قائمة مدير العائد على الاستثمار.

في مدير العائد على الاستثمار، انقر على القياس لحساب شدة النقاط النقطية. لتصور التغيرات مع مرور الوقت، ارسم متوسط الشدة بفواصل ثقة 95٪ لكل نقطة زمنية. عد حوالي 100 خلية لكل حالة.

في الخلايا المتوقفة G1، كان Stu2-GFP يتمركز في نقطة قريبة ذات قطب مغزل واحد مع إشارة مشتتة إضافية على طول الأنابيب الدقيقة السيتوبلازمية. بعد 60 دقيقة من الإطلاق، تم تحديد موقع Stu2-GFP كنقطتين متجاورتين لقطبين مغزلين مكررين معلمين ب Spc110-mCherry. بحلول 90 دقيقة، أثناء الانهيار، ظهر Stu2-GFP بالقرب من أقطاب المغزل وعلى طول الأنابيب الدقيقة التي تمتد على المحور الواحد.

بعد الخروج من الانقسام الانقساسي، عند 120 دقيقة، ظهر Stu2-GFP مجددا على الأنابيب الدقيقة الأثيرية في السيتوبلازم. كشفت الكمية أن شدة Stu2-GFP بالقرب من أقطاب المغزل زادت خلال الانقسام الميتوزيجي المبكر، وبلغت ذروتها قبل الطور ثم انخفضت بعد ذلك. بلغت نسبة الخلايا الثنائية النقيلة ذروتها عند حوالي 90 دقيقة، مما يشير إلى دخول متزامن إلى الطور الطبيعي.