تحليل للوضع النمط الظاهري المورفولوجية كدالة للتركيز البروتين في الخميرة الناشيء.

يستخدم هذا البروتوكول محفزا قابلا للتنظيم يسمح بالتعبير المتحكم فيه عن البروتين. في هذه التجربة ، نستخدم نسخة عالية من بلازميد ميكرون يعبر عن مجال N اثنين من محفز ميثيونين قابل للكبته. يتم تحويل خلايا الخميرة البرية مع هذا.

يتم اختيار البلازميد والمحولات على لوحات تفتقر إلى uol. بعد النمو بين عشية وضحاها. في الوسائط الانتقائية ، تتم مزامنة الخلايا عن طريق عدم وجود نمو بوساطة الكورتيزول. اعتقال.

أخيرا ، ويتم تحفيز التعبير عن طريق نقل الخلايا إلى الوسائط التي تفتقر إلى الميثيونين خلال تجربة الدورة الزمنية. تتم مراقبة تركيز البروتين عن طريق النشاف الغربي وتطور النمط الظاهري المورفولوجي عن طريق الفحص المجهري. مرحبا ، أنا كلوديا في قسم العلوم البيولوجية ، جامعة بوردو.

أنا دي باري موجي في alar وأنا وأيضا في مختبر AL. سنعرض لكم اليوم إجراء لتحليل تطور النمط الظاهري المورفولوجي كدالة لتركيز البروتين في الحث في الجسم. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة الجوانب المورفولوجية والجزيئية للنمط الظاهري لانقسام الخلية الذي لوحظ عند الإفراط في التعبير عن المجال N اثنين من البروتين التكيفي الداخلي الغائب عن اثنين.

لذلك دعونا نبدأ. يبدأ هذا البروتوكول ببناء سلالة الخميرة التي ستعبر عن البروتين الذي يثير اهتمامك. في حالتنا ، قمنا بتحويل سلالة الخميرة البرية W 3 0 3 مع الحمض النووي للبلازما عالي النسخ الذي يحتوي على nth اثنين تحت سيطرة مروج الميثيونين القابل للقمع ، والتقى اثنان من الميثيونين المليمولار ب 25 نشاط مروج.

في حين أن الوسائط التي تفتقر إلى الميثيونين تسمح بالتعبير الأقصى ، اختر ست مستعمرات من صفيحة تحتوي على خلايا محولة حديثا وتلقيح 50 مل من الوسائط الانتقائية مع 0.2 مللي مولار ميثيونين في قارورة مخروطية تحتضن بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة في صباح اليوم التالي. تقدير كثافة الخلية عن طريق قياس الكثافة البصرية للثقافة عند 600 نانومتر. نقل ما يعادل 20 OD 600 نانومتر لكل مليلتر من الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي معقم والحصاد عن طريق الطرد المركزي.

أعد تعليق الخلايا في وسط YPD عن طريق الدوامة لمزامنة دورة الخلية مع التركيز النهائي البالغ 15 ميكروغرام لكل مليلتر من مخزون واحد ملليغرام لكل مليلتر في DMSO. احتضان لمدة أربع ساعات عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة. بعد أربع ساعات ، تحقق من النسبة المئوية للخلايا التي تم القبض عليها في الانقسام.

من خلال المشاهدة تحت المجهر وحساب عدد الخلايا ذات البراعم المتساوية الحجم ، انتقل إلى الخطوة التالية. فقط إذا كان الاعتقال أكبر من 90٪ حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 2200 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. بعد ثلاث غسلات بالماء المثلج ، قم بتعليق الحبيبات في وسائط انتقائية تفتقر إلى الميثيونين بكثافة خلية تبلغ حوالي 0.5 OD 600 نانومتر لكل مليلتر.

انقل نصف حجم الخلايا إلى أنبوب معقم جديد وأضف الميثيونين إلى التركيز النهائي البالغ 0.2 ملليمول. سيكون هذا بمثابة تحكم في التأثيرات الناتجة عن المستويات الأساسية للتعبير عن البروتين. أعد كلتا الثقافتين إلى حاضنة 30 درجة مئوية.

يتم تحليل الخلايا لتطوير النمط الظاهري كل ساعة لمدة ست ساعات في كل مرة. قم بنقل مليلتر واحد من تعليق الخلية لكل ثقافة إلى أنبوب معقم دقيق وحصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وشفط المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في 70 ميكرولتر من الوسائط. ثم أضف 30 ميكرولترا من الميثيلين الأزرق من مخزون واحد ملليغرام لكل مليلتر في ماء معقم.

بعد ذلك ، ضع الماصة حوالي ستة ميكرولترات من هذا التعليق على شريحة زجاجية نظيفة وضع زلة غطاء فوق القطرة. اضغط على زلة الغطاء برفق لتشكيل طبقة رقيقة موحدة من الخلايا بين الواجهات الزجاجية. قسم شريحة الغلاف إلى تسعة أرباع والتقط ثلاث صور لكل ربع.

يجب ألا يزيد عدد الخلايا في كل حقل عن 30 خلية للسماح بالقياس الكمي بدقة. احسب عدد الخلايا التي تظهر النمط الظاهري قيد الدراسة ، والتي في هذا المثال هي خلايا خميرة ناشئة ذات براعم ممدودة و / أو متسلسلة تفشل في الانفصال عن بعضها البعض. نحسب أيضا عدد الخلايا الميتة التي تم تحديدها بلونها الأزرق منذ عيب انقسام الخلية الناجم عن nth.

يؤدي الإفراط في التعبير إلى موت الخلايا لتصور عيوب النمط الظاهري المحددة في كل مرة. ضع نقطة ملليلتر واحد من الثقافة في أنبوب طرود دقيق معقم وحصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي. حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من مليغرام واحد لكل مليلتر ، محلول أبيض كالور في ماء معقم واحتضانه لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام.

التلوين بالأبيض الكالسيور تصور جدار الخلية الإلكترونية. اغسل الحبيبات ثلاث مرات باستخدام XPBS واحد. نعلق الحبيبات النهائية في 100 ميكرولتر من PBS.

راقب الخلايا تحت المجهر واحصل على صور بتكبير 100 × باستخدام بصريات الأشعة فوق البنفسجية لتصور جدار الخلية. لتصور صورا بعلامة GFP ، اكتساب septin صورا باستخدام مرشح FS E ، قم بتحديد النسبة المئوية للخلايا التي بها عيوب في جدار الخلية وتوطين septin بشكل خاطئ باستخدام الطريقة الموضحة سابقا عن طريق تقسيم زلة الغطاء إلى تسعة أرباع والتقاط ثلاث صور لكل ربع لحساب فيديو TimeSpan. يتطلب الفحص المجهري لخلايا الخميرة المفردة أسرة agros مدمجة في الوسائط لصنع سرير agros.

قم أولا بتنظيف شريحة زجاجية ذات اكتئاب مقعر بنسبة 70٪ كحول واتركها تجف في الهواء أثناء تجفيف الشريحة بالهواء. قم بغلي 0.06 جرام من agros في خمسة ملليلتر من الوسائط الانتقائية التي تفتقر إلى الميثيونين في الميكروويف حتى يذوب agros بسرعة تامة. ماصة 200 ميكرولتر من agros تحتوي على وسائط في الشريحة.

الاكتئاب وعكس انزلاق زجاجي نظيف آخر فوقه ، مع التأكد من عدم وجود فقاعات هواء محاصرة تحتها. عندما يتجمد الجل ، حرك الشريحة في الأعلى بسلاسة بعيدا عن شريحة الاكتئاب ، مع الحفاظ على أسطحها متوازية في جميع الأوقات. هذا يضمن أن سطح سرير agros متدفق مع سطح شريحة الاكتئاب.

نظف منطقة الشريحة المحيطة بسرير agros بمنديل رقيق. الشريحة جاهزة الآن للاستخدام في الوقت الذي يساوي أربع ساعات. انقل ملليلتر واحد من الخلايا من المزرعة إلى أنبوب طرود دقيق معقم وحصادها بالطرد المركزي.

استنشق المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من الوسائط الانتقائية الطازجة التي تفتقر إلى الميثيونين. ضع الفازلين على حواف زلة الغطاء. ثم ضع قطرة من تعليق الخلية في وسط سرير agros وانتشر بشكل موحد عن طريق الضغط برفق على زلة الغطاء فوقه.

أغلق حواف زلة الغطاء وقم بتثبيت موضعه عن طريق تبطين الحواف بطلاء الأظافر. بمجرد أن يجف طلاء الأظافر ، ضع الشريحة على مرحلة ساخنة من المجهر. نستخدم مجهر Zeiss Axio 200 M المجهز بكاميرا رقمية أحادية اللون Zeiss Axio cammm و MRM لاختيار حقل لا يحتوي على أكثر من 10 خلايا متباعدة بشكل كاف لأن الحقل سوف يزدحم بمرور الوقت.

عندما تنقسم الخلايا ، التقط صورة للحقل كل خمس دقائق لمدة خمس ساعات تقريبا. لتجنب إعادة ضبط التركيز بشكل متكرر. نقوم ببرمجة برنامج الحصول على الصور للحصول تلقائيا على عدد قليل من صور Zack في كل نقطة زمنية.

سيتم اختيار الصورة ذات التركيز الأفضل لاحقا لتجميع الفيلم من أجل ضمان الحرارة الكافية للخلايا ، وهو مصدر خارجي للحرارة بالإضافة إلى المراحل الساخنة التي يتم توفيرها عن طريق ترك الضوء الأبيض المرسل للمجهر مضاء طوال مدة التصوير يمكن دراسة انحدار النمط الظاهري عن طريق تجميع الصور في فيلم باستخدام برنامج Image J. نعرض هنا نتائج تمثيلية للإفراط في التعبير عن البروتين الذي يثير اهتمامنا. تاجر اثنين.

أولا ، التعبير عن البروتين ل nth اثنين. خلال الفترة الزمنية للتجربة ، تم تحديد المحللات من الخلايا التي تعبر عن HA nth تم تحليلهما بواسطة النشاف الغربي باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد ل HA كما هو موضح في خلايا اللطخة المناعية التي نمت في وجود 0.2 مللي مولر ميثيونين لها الحد الأدنى من التعبير عن البروتين. ومع ذلك ، تظهر الخلايا المزروعة في الوسائط التي تفتقر إلى الميثيونين ارتفاعا ثابتا في تركيز S اثنين على مدار الوقت من التجربة.

تم تحليل الخلايا التالية التي نمت في وجود أو عدم وجود الميثيونين لمدة ست ساعات نظرا لأن تركيز nth المنخفض غير قادر على إحداث نمط ظاهري لانقسام الخلية أو موت الخلايا فقط. تموت نسبة منخفضة من الخلايا كما يتضح من لونها الأزرق بعد تلطيخها باللون الأزرق الميثيلين. وبالمثل ، فإن عدد النوى لكل خلية وجدار الخلية وتنظيم الحاجز طبيعي كما هو متوقع.

على النقيض من ذلك ، يؤدي التعبير عن M two إلى عيب هائل في انقسام الخلايا وموت الخلايا ، كما يتضح من السلاسل الطويلة من البراعم الممدودة المتصلة التي تحتفظ باللون الأزرق عند تلطيخها باللون الأزرق الميثيلين. معظم الخلايا المظهرية متعددة النوى كما يتضح من تلطيخ DPI. يوضح تلطيخ الكالسيور الأبيض تراكم بقع جدار الخلية غير الطبيعية.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن septin غير موضعي وغير منظم بشكل صارخ. يظهر القياس الكمي للنمط الظاهري كدالة للوقت في هذا الرسم البياني حيث تمثل الدوائر المفتوحة صفر ميثيونين مليمولار وتمثل الدوائر المغلقة 0.2 مللي مولر ميثيونين. نرى هنا أنه مع تراكم التركيز الثاني في الخلايا بمرور الوقت ، ترتفع أيضا النسبة المئوية للخلايا التي تظهر النمط الظاهري لانقسام الخلية.

نمت خلايا التحكم عند 0.2. يظهر ملي ميثيونين أن تطور النمط الظاهري هو دالة لارتفاع تركيز البروتين وليس بسبب ظروف زراعة الخلايا. أخيرا ، يتم التقاط تطور النمط الظاهري عند التعبير الزائد عن طريق الفحص المجهري بالفيديو بفاصل زمني.

بعد أربع ساعات من nth ، تظهر خليتان مفرطتان في التعبير نمطا ظاهريا خفيفا لتقسيم الخلايا المورفولوجية. مع تقدم الفيلم ، نرى فترات غير طبيعية وممتدة من نمو البراعم القمية ، مما يؤدي إلى ظهور براعم ممدودة للغاية. نرى أيضا أحداث ظهور براعم جديدة قبل حدوث حدث انفصال الخلية.

بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ أن البراعم تخرج من عدة مناطق من خلية الأم مما يؤدي إلى ظهور فرع. لقد أوضحنا لك للتو كيفية توصيف وتحليل تطور النمط الظاهري المورفولوجي كدالة لتركيز البروتين في قائمة الناشئة. من خلال القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر مداعبة الخلايا بسرعات الطرد المركزي الموصى بها لأن السرعات العالية قد تلحق الضرر بالخلايا.

من المهم أيضا أن تتذكر إضافة الميثيلين الأزرق والكلوريد قبل التصوير مباشرة لأنهما سامان للخلايا الشرقية الخفيفة. لذا شكرا على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.