التحليل الأمثل للبروتينات من بويضات Xenopus والأجنة عن طريق التنشيف المناعي

على مدار حياة ، تحدث قرارات الكبريتات باستمرار ، مما يسمح بالتطور الطبيعي وصحة الكائن الحي البالغ. تعتمد هذه القرارات على بروتينات معينة تشار إليها إلى منظمات الكبريتات. الهدف من بحثنا هو إيجاد الآليات التي تتحكم في تخليق هذه المنظمين المهمين.

بالإضافة إلى توفير مخطط تفصيلي للنشاف المناعي وبويضات Xenopus والأجنة ، يعطي بروتوكولنا نظرة ثاقبة للتحديات الشائعة لهذا الكائن الحي النموذجي ، مثل شراء الأجسام المضادة. من خلال الدراسة المتعمقة لآليات الربط والقمع ل Bicaudal C ، ساعد بحثنا في إنشاء أساس للمعلومات يمكن من خلاله مقارنة المنظمين الانتقاليين الآخرين. لبدء معالجة الخلايا من أجل التنظيف المناعي ، أضف 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل الخلايا المبردة المخفف إلى تركيز مرة واحدة مع ماء منزوع الأيونات مزدوج لكل جنين أو بويضة.

باستخدام مدقة صغيرة ، قم بتجانس العينات على الثلج. ضع الأنابيب في جهاز طرد مركزي على الطاولة وقم بتدوير العينات عند 5 ، 000 جم عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق إلى بقايا الحبيبات ، بما في ذلك صفار البيض والأصباغ غير القابلة للذوبان. انقل المادة الطافية إلى أنبوب نظيف سعة 1.5 مليلتر ، مما يضمن عدم إزعاج الحبيبات أثناء النقل.

أضف حجما متساويا من المخزن المؤقت لعينة Laemmli مرتين مع استكمال 5٪ من الوزن بالحجم 2-mercaptoethanol إلى الطافق الذي تم جمعه. سخني الخليط على حرارة 95 إلى 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لإضفاء طبيعة البروتينات. الآن ، قم بإزالة جل مسبقة الصب من 4 إلى 12٪ من عبوته وقم بإزالة الملصق من قاع الجل.

أدخل الجل في مجموعة القطب الكهربائي مقابل سد عازل ، وضع المجموعة بأكملها في خزان الرحلان الكهربائي الرأسي. بعد ذلك ، املأ كل من مجموعة القطب الكهربائي والجزء السفلي من الخزان بمخزن مؤقت للتشغيل Tris-MOPS-SDS. قم بإزالة مشط الجل والماصة برفق في الآبار للتخلص من الفقاعات وتوازن المخزن المؤقت.

الآن ، قم بتحميل خمسة ميكرولتر من معايير البروتين الملطخة مسبقا في البئر الأول و 10 ميكرولتر من كل عينة محضرة في الآبار المتبقية. ضع الغطاء على خزان الرحلان الكهربائي وقم بتوصيله بمصدر طاقة. بعد ذلك ، اضبط الجهد على 200 فولت لبدء الرحلان الكهربائي.

أوقف الرحلان الكهربائي بمجرد خروج واجهة صبغة العينة العازلة من الجل. قبل اكتمال الرحلان الكهربائي ، ابدأ في تجميع شطيرة النقل في مشبك النقل. املأ طبق خبز زجاجي بمخزن مؤقت للنقل المبرد واغمس جميع مواد النقل في هذا المخزن المؤقت أثناء التجميع.

ضع مشبك النقل في الطبق مع وضع النصف الأسود على الأسفل ، والنصف الأبيض موجه لأعلى ، وفتح المشبك إلى اليسار. ضع إسفنجة أو اثنتين من الألياف بشكل مسطح على النصف الأسود من مشبك النقل. بعد قطع قطعتين من ورق كروماتوغرافيا السليلوز 0.35 ملم حسب الحجم ، ضع واحدة فوق الإسفنج.

بمجرد اكتمال الرحلان الكهربائي ، قم بإزالة الجل من خزان الرحلان الكهربائي. باستخدام ذراع فتح كاسيت الجل ، قم بفصل ألواح الجل بعناية ، مع التأكد من بقاء الجل متصلا بجانب واحد. قم بقص الآبار من أعلى الجل باستخدام محرر الجل.

ضع الجل ، الذي لا يزال متصلا بنصف الكاسيت البلاستيكي ، على ورق الترشيح ، وقم بإزالة نصف الكاسيت المتبقي حتى يظل الجل مسطحا على الورق. بعد ذلك ، قم بقص قطعة من غشاء النيتروسليلوز 0.45 ميكرومتر لتتناسب مع أبعاد الجل. قم بإزالة الغشاء من ورقته الواقية ، وبلله لفترة وجيزة في المخزن المؤقت للنقل ، وضعه بعناية فوق الجل.

ثم ضع قطعة ثانية من ورق الترشيح فوق غشاء النيتروسليلوز. باستخدام الأسطوانة ، اضغط برفق ولكن بقوة على جميع فقاعات الهواء. قم بتكديس إسفنجة أو اثنتين من الإسفنج الليفي الإضافي فوق ورق الترشيح لإكمال الساندويتش.

أغلق كاسيت النقل وقم بتثبيته بإحكام لإغلاق الساندويتش المجمع. بعد ذلك ، أدخل شطيرة النقل المغلقة في قلب النقل بحيث يكون المشبك متجها لأعلى ، وتأكد من أن الجانب الأسود من المشبك يواجه الجانب الأسود من القلب. ضع قلب النقل في خزان الرحلان الكهربائي.

أضف كيس ثلج وقضيب تقليب إلى الخزان ، مما يضمن أن شريط التقليب يمكن أن يدور بحرية. املأ الخزان بمخزن مؤقت للنقل المبرد حتى يتم غمر الجهاز بالكامل ، وقم بتأمين الغطاء في الأعلى. قم بتوصيل الجهاز بمصدر الطاقة ، وقم بمطابقة ألوان القطب الكهربائي ، واضبط الظروف على 100 فولت لمدة ساعة واحدة مع دوران قضيب التحريك.

بمجرد اكتمال النقل ، افتح الكاسيت بعناية وقم بتفكيك الساندويتش. قم بإزالة غشاء النيتروسليلوز وحدد الجانب الذي كان ملامسا للجل. ثم ضع غشاء النيتروسليلوز في وعاء صغير بحيث يكون مسطحا على القاع.

قم بتغطية الغشاء بالكامل بصبغة Ponceau وصخر برفق على الروك لمدة 5 إلى 10 دقائق. بعد صب بقعة بونسو ، اشطف الغشاء عدة مرات بالماء منزوع الأيونات المزدوج حتى تتم إزالة البقعة الزائدة وتصبح عصابات البروتين مرئية في الممرات. بعد ذلك ، قم بإجراء حجب الغشاء وحضانة الأجسام المضادة وخطوات الغسيل كما هو موضح.

بمجرد اكتمال حضانة الأجسام المضادة الثانوية وغسلها ، يصبح الغشاء جاهزا للتصوير. في غرفة مظلمة ، قم بتشغيل مطور الفيلم واتركه يسخن. قطع مربعين من غلاف بلاستيكي كبيرين بما يكفي لتغطية الغشاء بالكامل.

باستخدام الملقط ، ضع غشاء النيتروسليلوز ووجهه لأعلى على المربع الأول من الغلاف البلاستيكي. في أنبوب سعة 1.5 مل، امزج كميات متساوية من الكواشف المحسنة للتلألؤ الكيميائي والمحسن. ثم استخدم ما يقرب من ملليلتر واحد من الخليط لتغطية معظم الأغشية.

باستخدام الغلاف البلاستيكي ، قم بمعالجة الغشاء برفق لضمان طلاء السطح بالكامل بالتساوي واحتضانه لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، قم بإزالة كاشف ECL الزائد عن طريق إمساك الغشاء بملقط والتخلص من السائل برفق. ضع الغشاء ووجهه لأعلى على المربع الثاني من الغلاف البلاستيكي ، وقم بطيه بشكل غير محكم فوق الغشاء ، وقم بلصق الغلاف بإحكام في كاسيت التصوير الشعاعي الذاتي.

بعد ذلك ، قم بتصوير الغشاء باستخدام فيلم التصوير الشعاعي الذاتي في غرفة مظلمة باتباع الخطوات الموضحة. بعد تحقيق تصور البروتين المطلوب ، قم بمحاذاة الفيلم المطور مع علامات التوهج في الظلام ، واستخدمها كدليل لتحديد موضع معايير البروتين الملطخة مسبقا على الفيلم. بمجرد اكتمال التصوير ، قم بإزالة الغشاء بعناية من الغلاف البلاستيكي وغمره في TBSTW لغسل كاشف ECL المتبقي.

أكد تلطيخ بونسو للغشاء نقل البروتين بنجاح. لم يتم الكشف عن بروتين B1 الداخلي في عينات البويضات ، ولكن تم اكتشافه بوضوح في عينات الأجنة في المرحلة السابعة والمرحلة 10.5 عند حوالي 107 كيلودالتون. تم الكشف عن نطاق بروتين أصغر يبلغ 70 كيلودالتون في العينات المحقونة عبر جميع المراحل باستخدام الجسم المضاد Bicc1 ، مما يشير إلى التعبير الناجح عن اندماج HA-Bicc1 C-terminal.

اكتشف الجسم المضاد HA نفس النطاق 70 كيلودالتون فقط في العينات المحقونة ، مما يؤكد خصوصية الجسم المضاد Bicc1 لبروتين الاندماج. تم الكشف عن نطاقين عالي الوزن الجزيئي ، حوالي 250 و 270 كيلودالتون ، في جميع العينات باستخدام الجسم المضاد CNOT1. تم الكشف عن التعبير عن بروتين DDX6 سعة 54 كيلودالتون في جميع العينات ، ولكن تم انخفاضه بشكل واضح في المرحلة 10.5 من الأجنة.