تحليل طخة مناعية

يستخدم النشاف المناعي ، الذي يشار إليه غالبا باسم النشاف الغربي ، لتحديد مستضدات معينة يتم التعرف عليها بواسطة الأجسام المضادة متعددة النسيلة أو أحادية النسيلة داخل عينة البروتين. يتبع هذا الإجراء عادة الرحلان الكهربائي للهلام واحد أو ثنائي الأبعاد ويتضمن نقل البروتينات المنفصلة إلى أغشية النيتروسليلوز. حضانة هذه الأغشية بالأجسام المضادة الأولية والثانوية ، المترافقة بشكل مباشر أو غير مباشر مع الإنزيمات وتصور مستضدات البروتين على هذه الأغشية باستخدام تفاعلات الركيزة الملونة أو الفلورية.

في هذا الفيديو ، نقدم عرضا توضيحيا خطوة بخطوة لإجراء النشاف المناعي. مرحبا ، أنا شون غالاغر من UVPI أتعاون مع مركز البروتينات هنا في معهد الدراسات العليا KE. سأريكم اليوم تحليل النشاف المناعي.

يتضمن عددا من الخطوات بما في ذلك فصل البروتين ، ونشاف البروتينات على الأغشية ، والفحص المناعي والتصور باستخدام ركائز تلألؤ اللونات وكيم. لذلك دعونا نبدأ. قبل البدء في إجراء النشاف المناعي ، يجب أولا فصل عينات البروتين عن طريق الرحلان الكهربائي باستخدام مواد هلامية صغيرة أو قياسية الحجم أحادية الأبعاد أو ثنائي البعد.

قم بإعداد عينات المستضدات وتحميلها في الممرات الموجودة على الجل ، بما في ذلك البروتين الملون مسبقا أو البيوتينيل ، ومعايير الوزن الجزيئي في واحد أو أكثر من ممرات الجل. ستنتقل علامات البروتين هذه إلى الغشاء وتشير بشكل ملائم إلى اتجاه الغشاء وأحجام البروتينات بعد التلوين المناعي. بمجرد اكتمال الرحلان الكهربائي ، نكون مستعدين لتجميع اللطخة المناعية.

لتجميع البقعة المناعية أولا ، قم بتفكيك شطيرة الجل وإزالة هلام التكديس قم بموازنة الجل لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في المخزن المؤقت للنقل ، هذا التوازن مطلوب لمنع حدوث تغيير في حجم الجل أثناء النقل أثناء توازن الجل. ابدأ في تجميع شطيرة النقل في صينية كبيرة بما يكفي لحمل علبة النقل البلاستيكية المملوءة بمخزن مؤقت للنقل بحيث يتم تغطية الكاسيت. الآن ضع وسادة أو إسفنجة ساطعة سكوتش على النصف السفلي من كاسيت النقل البلاستيكي.

ثم خذ ورقة من ورق الترشيح التي تم قصها بنفس حجم الجل. بللها مسبقا باستخدام عازلة النقل وضعها فوق وسادة سكوتش الساطعة. بمجرد الانتهاء من توازن الهلام لمدة 30 دقيقة ، ضع الجل فوق ورق الترشيح.

قم بإزالة أي فقاعات هواء بين الجل وورق الترشيح عن طريق لف أنبوب اختبار أو قضيب زجاجي برفق على سطح الجل. أو يمكنك استخدام أسطوانة BioRad ، التي تأتي مع مجموعة BioRad. تذكر استخدام القفازات عند التلاعب بأوراق الترشيح والمواد الهلامية والأغشية.

الزيت من يديك سيمنع النقل. بعد ذلك ، قم بإعداد غشاء النقل. اقطع الغشاء بنفس حجم الجل بالإضافة إلى ملليمتر إلى ملليمتر واحد على كل حافة.

ثم ضع الغشاء في الماء المقطر ببطء بحافة واحدة بزاوية 45 درجة ، وسوف يفتل الماء في الغشاء ويبلل السطح بالكامل في النهاية. إذا تم إدخاله مرتين بسرعة في الماء ، فإن الهواء يحبس وسيظهر على شكل بقع بيضاء في الغشاء. لن ينتقل البروتين إلى هذه المناطق.

بمجرد أن يصبح الغشاء رطبا تماما ، قم بتوازنه لمدة 10 إلى 15 دقيقة ونقل المخزن المؤقت. يعمل إجراء الترطيب هذا مع أغشية النيتروسليلوز والنايلون. أغشية PVDF فقط كارهة للماء ولن تبلل ببساطة من وضعها في الماء المقطر أو نقلها. مخزن مؤقت.

يجب أولا غمر أغشية PVDF في 100٪ من الميثانول لمدة ثانية إلى ثانيتين ، ثم التوازن لمدة 10 إلى 15 دقيقة. في المخزن المؤقت للنقل. لا تدع الغشاء يجف في أي وقت.

إذا حدث هذا رطبا مرة أخرى بالميثانول ثم المخزن المؤقت للنقل. بمجرد أن يصبح الغشاء جاهزا ، ضع الغشاء المبلل مسبقا مباشرة على الجانب العلوي من الجل. تذكر إزالة جميع فقاعات الهواء بين الجل والغشاء عن طريق لف قضيب زجاجي لأنبوب الاختبار برفق أو أسطوانة BioRad على سطح الغشاء.

بعد ذلك ، قطعة أخرى من ورق الترشيح بثلاثة مم. ثم ضعه فوق الغشاء ومرة أخرى ، قم بإزالة جميع فقاعات الهواء. ثم ضع وسادة أو إسفنجة أخرى من السكوتش فوق ورق الترشيح هذا.

أكمل تجميع شطيرة اللطخة المناعية عن طريق قفل النصف العلوي من كاسيت النقل في مكانه. الآن بعد أن تم تجميع شطيرة اللطخة المناعية ، أصبحنا على استعداد لنقل البروتينات من الجل إلى الغشاء. لبدء إجراء النقل ، املأ خزان النشاف الكهربائي بمخزن مؤقت للنقل وضع كاسيت النقل الذي يحتوي على الساندويتش في جهاز النشاف الكهربائي.

من المهم للشطيرة بحيث يواجه الغشاء الأنود أو الجانب الموجب المشحون من الخزان. قم بتوصيل أسلاك مصدر الطاقة بجوانب الأنود والكاثود المقابلة لجهاز النشاف الكهربائي. يأتي نشاف المعيار المعيار هذا مع كتلة ثلجية باردة.

الآن ، تنقل البروتينات الكهربية من هلام إلى غشاء لمدة 30 إلى 60 دقيقة عند 50 فولت مع التبريد أو بين عشية وضحاها عند 14 فولت في غرفة باردة. عند الانتهاء من النقل ، قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة وتفكيك الجهاز. ثم قم بإزالة الغشاء من جهاز النشاف ولاحظ الاتجاه عن طريق قطع الزاوية.

في هذه المرحلة ، يمكن تجفيف الأغشية وتخزينها في كيس بلاستيكي قابل لإعادة الإغلاق عند أربع درجات مئوية لمدة عام واحد. قبل المعالجة الإضافية ، يجب وضع أغشية PVDF المجففة في كمية صغيرة من الميثانول بنسبة 100٪ لترطيب الغشاء. ثم في الماء المقطر لإزالة الميثانول.

بمجرد تحديد الاتجاه ، قم بتلطيخ الجل للتحقق من كفاءة النقل. لتصور البروتينات المنقولة ، يمكنك إما تلطيخ الغشاء بشكل عكسي باستخدام سيبرو روبي أو بشكل لا رجعة فيه بحبر كاماسي الأزرق الهندي أو أزرق النافثول أو الذهب الغروي. إجراءات التلوين التي لا رجعة فيها هذه غير متوافقة مع أغشية النايلون.

الآن بعد أن تم نقل البروتينات إلى الغشاء ، استمر في التحقيق المناعي والكشف البصري عن البروتينات. في هذه الخطوة ، يتم فحص البروتينات المجمدة على الغشاء بأجسام مضادة محددة لتحديد وتحديد أي مستضدات موجودة. للبدء ، ضع الغشاء في صينية حضانة بلاستيكية مع 20 مل مانع عازل.

يستخدم بعض الأشخاص الأكياس ، ولكن غالبا ما يتم استخدام الصواني بدلا من ذلك لأنها مفيدة بشكل خاص عند معالجة أعداد كبيرة من الشرائط في محاليل الأجسام المضادة الأولية المختلفة. بعد ذلك ، احتضان الغشاء المغلق لمدة 30 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع التحريض على شاكر مداري أو منصة هزاز. أثناء احتضان الغشاء ، قم بتخفيف الجسم المضاد الأساسي ومنع المخزن المؤقت.

يتم تحديد التخفيف تجريبيا ، ولكن عادة ما يكون واحدا إلى 100 إلى واحد إلى 1000. بالنسبة للأجسام المضادة متعددة النسيلة ، واحد إلى 10 إلى واحد في 100 للطافية الهجينة وأكبر من واحد إلى 1000 لسائل أحماض الفئران الذي يحتوي على أجسام مضادة وحيدة النسيلة. عند الانتهاء من الحضانة ، اسكب المخزن المؤقت للحظر.

استبدل المخزن المؤقت بجسم مضاد أولي مخفف ، ومرة أخرى ، احتضن لمدة 30 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع تحريض مستمر. بعد ذلك ، اغسل الغشاء أربع مرات عن طريق التحريك ب 100 ملليلتر. TTBS لمرشحات النيتروسليلوز أو PVDF أو TBS لمرشحات النايلون.

يغسل لمدة 10 إلى 15 دقيقة في كل مرة أثناء غسل الغشاء ، وقم بتخفيف الجسم المضاد الثانوي في المخزن المؤقت المانع. تشمل أمثلة الأجسام المضادة الثانوية بيروكسيداز فجل الحصان أو الفوسفاتيز القلوي ، ومضاد IG المترافق ، والإنزيم المترافق المتاح تجاريا. عادة ما يتم تخفيف الأجسام المضادة الثانوية من واحد إلى 200 إلى واحد إلى 25000 قبل الاستخدام.

بعد الانتهاء من خطوات الغسيل والتخلص من مواد الغسيل ، أضف بيروكسيداز فجل الحصان المخفف أو الفوسفاتيز القلوي ، ومترافق مضاد IG واحتضانه لمدة 30 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع تحريض مستمر. بعد 30 إلى 60 دقيقة ، قم بإزالة الغشاء من الحاوية واغسله أربع مرات ، من 10 إلى 15 دقيقة في كل مرة. في TTBS كما هو موضح سابقا.

بمجرد اكتمال عمليات الغسيل ، نكون على استعداد للمضي قدما في خطوة التصور. لكن أولا ، سنعرض إجراء فحص مناعي بديل. يعتمد إجراء الفحص المناعي البديل هذا على مجموعة صبغة ناقلات A BC من Vector Labs.

يستخدم مركب بيوتين أفيدان لربط بيروكسيداز فجل الحصان أو HRPO أو الفوسفاتيز القلوي A A P بالجسم المضاد الثانوي البيوتينيل. اليوم سنعرض مجموعة HRPO. TTBS مناسب تماما كمخزن مؤقت للحجب لأنظمة البيوتين أفادون.

ولكن بالنسبة لمرشحات النايلون ، يوصى باستخدام كواشف ربط البروتين لأن الحليب الجاف الخالي من الدسم يحتوي على البيوتين المتبقي ، والذي سيتداخل مع المقايسة المناعية. يجب استخدامه في خطوة الحجب فقط لبدء موازنة الغشاء في سد المخزن المؤقت في صينية مفتوحة مع تحريك مستمر باستخدام شاكر مداري أو منصة هزازة. احتضن الغشاء لمدة 30 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بينما يكون الغشاء متوازنا.

تحضير محلول الأجسام المضادة الأساسي. استخدم TTBS لأغشية النيتروسليلوز أو PVDF ذات الحساسية العالية عدن. أنظمة البيوتين.

يتراوح تخفيف cera الذي يحتوي على أجسام مضادة أولية بشكل عام من واحد في 1000 إلى واحد من كل 100،000. يتطلب استخدام كيمياء المضيئة الكيميائية نطاقا أعلى من التخفيفات. في حالتنا ، إظهار الكروموجين.

نحن نستخدم مخففا واحدا في 5000 من الأساسي. بمجرد الانتهاء من التوازن الإلكتروني ، قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر. ثم أضف ما يكفي من محلول الأجسام المضادة الأولية لتغطية الغشاء.

احتضن الغشاء لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع هزاز لطيف بعد 30 دقيقة. اغسل الغشاء ثلاث مرات في TTBS للنيتروسليلوز كل خمس دقائق أثناء خطوة الغسيل ، قم بإعداد محلول الأجسام المضادة الثانوية البيوتينيل عن طريق تخفيف قطرة واحدة من الجسم المضاد البيوتينيل ب 10 ملليلتر من TTBS. بمجرد الانتهاء من خطوات الغسيل ، أضف محلول الجسم المضاد الثانوي.

احتضان الغشاء لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع هزاز بطيء أثناء تحضين الغشاء بجسم مضاد ثانوي. قم بإعداد أفادون بيوتين HRPO للقيام بذلك. امزج قطرتين من كاشف وصمة عار vti A وقطرتين من الكاشف B في 10 ملليلتر.

TTBS للنيتروسليلوز. احتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة عند اكتمال حضانة الجسم المضاد الثانوي. اغسل الغشاء ثلاث مرات على مدى 15 دقيقة باستخدام TTBS أو TBS.

بعد ذلك ، أضف محلول إنزيم البيوتين أفيدان إلى الغشاء واحتضنه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع التأرجح البطيء. ثم اغسل الغشاء ثلاث مرات كل 10 دقائق باستخدام TTBS. الآن بعد اكتمال إجراء الفحص المناعي ، أصبحت البروتينات المرتبطة بالغشاء جاهزة للتصور باستخدام ركائز كروموجينيك.

بالنسبة لخطوة التصور النهائية هذه ، يتم استخدام الركائز الأربعة CN dab slash ICL two و TMB بشكل شائع مع فجل الحصان وإجراءات الكشف المناعي القائمة على البيروكسيديز. إذا تم إجراء الغسيل الغشائي النهائي أثناء إجراء المسبار المناعي في TTBS ، فقم بغسل الغشاء لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة و 50 ملليلترا. يضع TBS الآن الغشاء في محلول تصور كروموجينيك.

يجب أن تظهر عصابات البروتين في غضون 10 إلى 30 دقيقة. بعد الحضانة لمدة 30 دقيقة ، تخلص من خليط تفاعل الركيزة وقم بإنهاء التفاعل بإضافة الماء المقطر. النشاف المناعي هو إجراء متعدد الخطوات تستخدمه آلاف المختبرات للكشف عن وجود بروتينات معينة بعد الرحلان الكهربائي واحد أو ثنائي الأبعاد.

لقد أوضحت لكم للتو كيفية إجراء تحليل الدم المناعي. هذا كل شيء. حظا سعيدا في تجاربك وشكرا على المشاهدة.