اختبار تحليل التخثر: منصة قائمة على الميكروفلويدكس لتوصيف شامل لتكون الجلطة الميكانيكية الحيوية بشكل شامل

لقد طورنا طريقة جديدة يمكنها التقاط الخصائص البيوميكانيكية للجلطة بشكل كاف وأيضا اكتشاف التشوهات البروتروبوتوفية لدى البشر. للبدء، استخدم رقاقة سيليكون لصنع قالب رئيسي من نوع SU8 فوتوريست عبر الطباعة الضوئية القياسية المبنية على التصميم وتثبيت القالب الرئيسي في أسفل طبق بتري بقطر 15 سنتيمترا باستخدام شريط لاصق. تحضير خليط بولي ديميثيل سيلوكسان، أو PDMS، عن طريق خلط قاعدة ما قبل البوليمر وعامل المعالجة من مجموعة الإلاستومر السيليكون بنسبة وزن 10 إلى 1.

صب خليط PDMS على القالب الرئيسي. ثم ضع اللوحة التي تحتوي على خليط PDMS في مجفف فراغ لإزالة الغازات. يتم معالجة خليط PDMS حراريا عن طريق وضعه في حاضنة مضبوطة على 75 درجة مئوية لمدة ساعتين.

بعد إزالة العينة من الحاضنة، قم بقطع PDMS المعالجة بعناية من القالب الرئيسي، وقسم PDMS المعالجة إلى وحدات شرائح فردية. باستخدام إبرة المسبار، قم بثقب ثقوب في المواقع المحددة لإنشاء المدخل والمخرج. في غطاء المحرك الكيميائي، استخدم مناديل مبللة بنسبة 75٪ إيثانول لتنظيف شرائح الزجاج وتجفيفها.

بعد ذلك، باستخدام مولد عالي التردد، عالج شرائح الزجاج لمدة 30 ثانية وشرائح PDMS لمدة 20 ثانية. قم بمحاذاة كل شريحة باستخدام شريحة زجاجية واضغط الشريحة برفق على سطح الشريحة الزجاجية لربطها. الآن قم بربط الأجهزة حراريا بوضعها في فرن مضبوط على 150 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

بعد الربط، خزن الأجهزة في درجة حرارة الغرفة وتحت ظروف خالية من الغبار. ثم، باستخدام كماشة، قم بإزالة الجزء البلاستيكي من إبر المجس وثني الأنابيب المعدنية إلى 90 درجة لإنشاء موصلات لأجهزة الميكروفلويدك. بعد إعداد التفاعلات لاقتراب الفيبرينوجين والأجسام المضادة المطلوبة باستخدام أليكسا فلور، قم بعمل طرد مركزي على أعمدة التنقية عند 1,100 جرام لمدة دقيقتين لإزالة مخزن التخزين.

بعد التخلص من التدفق، تحميل محلول التفاعل على عمود التنقية المثبت في قارورة تجميع متوافقة وجهاز طرد مركزي عند 1,100 جرام لمدة خمس دقائق لجمع الخليط المطلوب. باستخدام مقياس طياف، قس امتصاص البروتين وإشارة الصبغة. احسب تركيز البروتين ونسبة الفلورة إلى المولار البروتينية.

خزن الأصباغ عند أربع درجات مئوية في الظلام. أضف الهيبارين إلى مخزن تايرود إلى تركيز نهائي 0.32 وحدة لكل ملليلتر لكل 10 ملليلتر من الدم المراد جمعه، وتحضير الحقنة عن طريق استنشاق 500 ميكرولتر من حاجز تايرود عند درجة حموضة 7.4. بعد جمع الدم عبر الوريدي في الحقنة التي تحتوي على الهيبارين، انقله إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 15 ملليلتر وحافظ على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية.

قم بتخفيف مونومر عامل فون ويلبراند إلى اثنين ميكروغرام لكل ملليلتر في PBS. قم بطلاء الأجهزة الميكروفلويدية بمونومر عامل فون ويلبراند المخفف واحتضنها لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. الآن حضن عينة الدم باستخدام مجموعة مستشعر الفلورسنت 1 أو 2 لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، قم بتوصيل جهاز ميكروفلويديك مع موصلات ومخارج وأنابيب. قم بتوصيل الطرف الآخر من موصل المدخل بأنبوب يحتوي على PBS، ثم وصل الطرف الآخر من موصل المخرج إلى حقنة. قم بتركيب الحقنة على مضخة الحقنة والجهاز الميكروفلويديك على مجهر مقلوب.

قم بتحريك مرحلة المجهر يدويا لتحديد موقع الضيق. املأ قناة الميكروفلويديك والأنابيب بأنابيب PBS باستخدام مضخة الحقنة بمعدل تدفق 0.5 ملليلتر في الدقيقة. افحص الجهاز للتأكد من عدم وجود فقاعات هواء حول موقع التضيق.

اربط أنبوب الإدخال بعينة الدم وقم بتمرير عينة الدم عبر قناة الميكروفلويديك باستخدام مضخة الحقنة بمعدل تدفق 0.018 ملليلتر في الدقيقة. في المجهر المقلوب، اضبط وقت التعريض والكسب لكل قناة فلورية في البرنامج. قم بتصوير فلوري متعدد الألوان في الوقت الحقيقي عن طريق التناوب بين القنوات الأربع وتحفيز فلور-4 واحد في كل مرة.

اضبط مستوى التركيز على الجلطة وسجل إشارات الفلورسنت في موقع التضيق لمدة 15 إلى 30 دقيقة. لتحليل البيانات، افتح ملف البيانات باستخدام إصدار ImageJ 1.53. استخدم قناة SZ 22 fit C لتحديد شكل الجلطة.

ثم باستخدام اختيارات المضلعات، اختر تقريبا منطقة الجلطة. لكل قناة، قم بإزالة إشارة الخلفية باختيار الصورة، ثم اختيار تعديل، ثم اختيار العتبة. وأخيرا، قس المساحة ومتوسط شدة الإشارة داخل الجلطة باختيار تحليل واختيار القياس.

أظهرت اللقطات التمثيلية تشكلت في الدم السليم داخل القناة الضيقة باستخدام الصفائح الدموية، والفيبرينوجين، وعامل فون ويلبراند، وP-selectin تم تصورها باستخدام مجموعة المستشعرات 1، والصفائح الدموية والفوسفاتيديلسرين والإنتجين الإيجابي E ألفا IIb بيتا 3، والإنتجرين المنشط ألفا IIb بيتا 3 الذي تم تصوره باستخدام مجموعة المستشعر 2. تمت معالجة صورة قناة فلورية واحدة عن طريق اختيار منطقة الجلطة، وإزالة الإشارة الخلفية، وقياس مساحة الإشارة ومتوسط السطوع لتمكين التحليل الكمي. أدى التحليل المستمر لشدة إشارة الفلورسنت مع مرور الوقت إلى توليد منحنى إشارة مقابل زمن لتراكم الصفائح الدموية أثناء تكوين الخثرات.

لكل نقطة زمنية، تم الحصول على شدة الإشارة الكلية لأربعة مؤشرات حيوية في مجموعة المستشعرات الأولى وأربع مؤشرات حيوية في مجموعة المستشعرات الثانية. تم حساب حجم الجلطة وتم إنشاء ملف تخثري سبعة أبعاد. حاليا، لا يوجد اختبار حيوي لتقييم ميل المرضى البشريين إلى البروترومبوت، ويحاول عملنا سد هذه الفجوة.

من خلال اكتشاف النشاط البيوميكانيكي لعينات الدم، يمكن لاختبارنا تقييم خصائص البروترومبوتيك بشكل شامل. يمكن تطوير اختبارنا ليصبح اختبارا سريريا للكشف عن الميل للبروترومبوتات لدى المرضى، ويمكن استخدامه أيضا لفحص الأدوية المضادة للجلطات من الجيل القادم.