اختبار تحليل التخثر: منصة قائمة على الميكروفلويدكس لتوصيف شامل لتكون الجلطة الميكانيكية الحيوية بشكل شامل
January 9th, 2026
يصف هذا العمل اختبارا ميكروفلويديا يستخدم إجهاد القص لتحفيز تكوين الجلطات في الدم ويصف الجلطة بأبعاد متعددة من القراءة. يمكن للاختبار قياس ميل عينات الدم إلى البروترومبوت، وبالتالي فهو مفيد في تشخيص الأمراض، واكتشاف الأدوية، وكذلك في الدراسات الميكانيكية الأساسية المتعلقة بالجلطة.
لقد طورنا طريقة جديدة يمكنها التقاط الخصائص البيوميكانيكية للجلطة بشكل كاف وأيضا اكتشاف التشوهات البروتروبوتوفية لدى البشر. للبدء، استخدم رقاقة سيليكون لصنع قالب رئيسي من نوع SU8 فوتوريست عبر الطباعة الضوئية القياسية المبنية على التصميم وتثبيت القالب الرئيسي في أسفل طبق بتري بقطر 15 سنتيمترا باستخدام شريط لاصق. تحضير خليط بولي ديميثيل سيلوكسان، أو PDMS، عن طريق خلط قاعدة ما قبل البوليمر وعامل المعالجة من مجموعة الإلاستومر السيليكون بنسبة وزن 10 إلى 1.
صب خليط PDMS على القالب الرئيسي. ثم ضع اللوحة التي تحتوي على خليط PDMS في مجفف فراغ لإزالة الغازات. يتم معالجة خليط PDMS حراريا عن طريق وضعه في حاضنة مضبوطة على 75 درجة مئوية لمدة ساعتين.
بعد إزالة العينة من الحاضنة، قم بقطع PDMS المعالجة بعناية من القالب الرئيسي، وقسم PDMS المعالجة إلى وحدات شرائح فردية. باستخدام إبرة المسبار، قم بثقب ثقوب في المواقع المحددة لإنشاء المدخل والمخرج. في غطاء المحرك الكيميائي، استخدم مناديل مبللة بنسبة 75٪ إيثانول لتنظيف شرائح الزجاج وتجفيفها.
بعد ذلك، باستخدام مولد عالي التردد، عالج شرائح الزجاج لمدة 30 ثانية وشرائح PDMS لمدة 20 ثانية. قم بمحاذاة كل شريحة باستخدام شريحة زجاجية واضغط الشريحة برفق على سطح الشريحة الزجاجية لربطها. الآن قم بربط الأجهزة حراريا بوضعها في فرن مضبوط على 150 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
بعد الربط، خزن الأجهزة في درجة حرارة الغرفة وتحت ظروف خالية من الغبار. ثم، باستخدام كماشة، قم بإزالة الجزء البلاستيكي من إبر المجس وثني الأنابيب المعدنية إلى 90 درجة لإنشاء موصلات لأجهزة الميكروفلويدك. بعد إعداد التفاعلات لاقتراب الفيبرينوجين والأجسام المضادة المطلوبة باستخدام أليكسا فلور، قم بعمل طرد مركزي على أعمدة التنقية عند 1,100 جرام لمدة دقيقتين لإزالة مخزن التخزين.
بعد التخلص من التدفق، تحميل محلول التفاعل على عمود التنقية المثبت في قارورة تجميع متوافقة وجهاز طرد مركزي عند 1,100 جرام لمدة خمس دقائق لجمع الخليط المطلوب. باستخدام مقياس طياف، قس امتصاص البروتين وإشارة الصبغة. احسب تركيز البروتين ونسبة الفلورة إلى المولار البروتينية.
خزن الأصباغ عند أربع درجات مئوية في الظلام. أضف الهيبارين إلى مخزن تايرود إلى تركيز نهائي 0.32 وحدة لكل ملليلتر لكل 10 ملليلتر من الدم المراد جمعه، وتحضير الحقنة عن طريق استنشاق 500 ميكرولتر من حاجز تايرود عند درجة حموضة 7.4. بعد جمع الدم عبر الوريدي في الحقنة التي تحتوي على الهيبارين، انقله إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 15 ملليلتر وحافظ على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية.
قم بتخفيف مونومر عامل فون ويلبراند إلى اثنين ميكروغرام لكل ملليلتر في PBS. قم بطلاء الأجهزة الميكروفلويدية بمونومر عامل فون ويلبراند المخفف واحتضنها لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. الآن حضن عينة الدم باستخدام مجموعة مستشعر الفلورسنت 1 أو 2 لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
بعد ذلك، قم بتوصيل جهاز ميكروفلويديك مع موصلات ومخارج وأنابيب. قم بتوصيل الطرف الآخر من موصل المدخل بأنبوب يحتوي على PBS، ثم وصل الطرف الآخر من موصل المخرج إلى حقنة. قم بتركيب الحقنة على مضخة الحقنة والجهاز الميكروفلويديك على مجهر مقلوب.
قم بتحريك مرحلة المجهر يدويا لتحديد موقع الضيق. املأ قناة الميكروفلويديك والأنابيب بأنابيب PBS باستخدام مضخة الحقنة بمعدل تدفق 0.5 ملليلتر في الدقيقة. افحص الجهاز للتأكد من عدم وجود فقاعات هواء حول موقع التضيق.
اربط أنبوب الإدخال بعينة الدم وقم بتمرير عينة الدم عبر قناة الميكروفلويديك باستخدام مضخة الحقنة بمعدل تدفق 0.018 ملليلتر في الدقيقة. في المجهر المقلوب، اضبط وقت التعريض والكسب لكل قناة فلورية في البرنامج. قم بتصوير فلوري متعدد الألوان في الوقت الحقيقي عن طريق التناوب بين القنوات الأربع وتحفيز فلور-4 واحد في كل مرة.
اضبط مستوى التركيز على الجلطة وسجل إشارات الفلورسنت في موقع التضيق لمدة 15 إلى 30 دقيقة. لتحليل البيانات، افتح ملف البيانات باستخدام إصدار ImageJ 1.53. استخدم قناة SZ 22 fit C لتحديد شكل الجلطة.
ثم باستخدام اختيارات المضلعات، اختر تقريبا منطقة الجلطة. لكل قناة، قم بإزالة إشارة الخلفية باختيار الصورة، ثم اختيار تعديل، ثم اختيار العتبة. وأخيرا، قس المساحة ومتوسط شدة الإشارة داخل الجلطة باختيار تحليل واختيار القياس.
أظهرت اللقطات التمثيلية تشكلت في الدم السليم داخل القناة الضيقة باستخدام الصفائح الدموية، والفيبرينوجين، وعامل فون ويلبراند، وP-selectin تم تصورها باستخدام مجموعة المستشعرات 1، والصفائح الدموية والفوسفاتيديلسرين والإنتجين الإيجابي E ألفا IIb بيتا 3، والإنتجرين المنشط ألفا IIb بيتا 3 الذي تم تصوره باستخدام مجموعة المستشعر 2. تمت معالجة صورة قناة فلورية واحدة عن طريق اختيار منطقة الجلطة، وإزالة الإشارة الخلفية، وقياس مساحة الإشارة ومتوسط السطوع لتمكين التحليل الكمي. أدى التحليل المستمر لشدة إشارة الفلورسنت مع مرور الوقت إلى توليد منحنى إشارة مقابل زمن لتراكم الصفائح الدموية أثناء تكوين الخثرات.
لكل نقطة زمنية، تم الحصول على شدة الإشارة الكلية لأربعة مؤشرات حيوية في مجموعة المستشعرات الأولى وأربع مؤشرات حيوية في مجموعة المستشعرات الثانية. تم حساب حجم الجلطة وتم إنشاء ملف تخثري سبعة أبعاد. حاليا، لا يوجد اختبار حيوي لتقييم ميل المرضى البشريين إلى البروترومبوت، ويحاول عملنا سد هذه الفجوة.
من خلال اكتشاف النشاط البيوميكانيكي لعينات الدم، يمكن لاختبارنا تقييم خصائص البروترومبوتيك بشكل شامل. يمكن تطوير اختبارنا ليصبح اختبارا سريريا للكشف عن الميل للبروترومبوتات لدى المرضى، ويمكن استخدامه أيضا لفحص الأدوية المضادة للجلطات من الجيل القادم.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
This article presents a novel thrombus profiling assay that integrates microfluidics with multi-color fluorescence imaging to comprehensively characterize biomechanical thrombogenesis. The method enables detailed analysis of thrombus formation under arterial shear conditions, providing seven distinct readouts related to thrombus size, composition, and platelet activation. This assay addresses the need for a robust bioassay to evaluate prothrombotic tendencies in humans and assess the efficacy of anti-thrombotic agents.
Key Study Components
Area of Science
- Hematology
- Bioengineering
- Microfluidics
- Thrombosis research
Background
- Thrombosis involves abnormal accumulation of platelets and clotting factors in blood vessels.
- Arterial thrombosis is often linked to elevated shear stress due to arterial stenosis.
- Biomechanical factors, such as blood flow, play a critical role in thrombus formation.
- Existing assays have not fully captured the biomechanical aspects of thrombogenesis.
Purpose of Study
- To develop an assay that profiles biomechanical thrombogenesis in detail.
- To enable comprehensive evaluation of prothrombotic tendencies in human blood samples.
- To provide a platform for testing anti-thrombotic agents and understanding arterial thrombosis mechanisms.
Methods Used
- Fabrication of microfluidic devices using PDMS and photolithography.
- Surface coating of microchannels with von Willebrand factor.
- Perfusion of heparinized human blood labeled with fluorescent biomarkers through stenotic microchannels.
- Real-time multi-color fluorescence imaging to monitor thrombus formation at the site of stenosis.
- Quantitative image analysis using ImageJ to measure thrombus area, biomarker signal intensity, and generate seven-dimensional thrombus profiles.
Main Results
- The assay successfully visualized and quantified thrombus formation under biomechanical (shear) conditions.
- Seven key parameters, including thrombus size and multiple biomarker signals, were measured simultaneously.
- Distinct profiles were generated for platelet accumulation, fibrinogen, von Willebrand factor, P-selectin, phosphatidylserine, and integrin activation.
- The method enabled continuous monitoring and quantitative analysis of thrombus development over time.
Conclusions
- This thrombus profiling assay fills a critical gap in evaluating biomechanical thrombogenesis.
- It offers a comprehensive tool for assessing prothrombotic risk and screening anti-thrombotic drugs.
- The approach can be further developed for clinical diagnostics and mechanistic studies of arterial thrombosis.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Biomechanical thrombogenesis presents a critical challenge in cardiovascular drug discovery, as traditional assays often fail to capture the complexity of thrombus formation under arterial shear conditions. The microfluidics-based thrombus profiling assay enables comprehensive, quantitative characterization of thrombus size, composition, and platelet activation, directly supporting predictive confidence in early-stage anti-thrombotic agent evaluation. This platform advances portfolio decision-making by providing mechanistic insights and robust risk assessment for candidate therapies targeting arterial thrombosis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of biomechanical pathways driving arterial thrombosis.
- Supports functional validation of targets involved in platelet activation and aggregation.
- Facilitates mechanistic de-risking by quantifying multiple thrombus biomarkers simultaneously.
- Improves predictive confidence for triaging anti-thrombotic candidates.
Screening & Assay Development
- Prepares validated microfluidic systems for high-content screening of anti-thrombotic compounds.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative multi-parametric readouts.
- Enables scalable, platform-based evaluation of compound efficacy under physiologically relevant shear conditions.
- Supports reliable comparison of compound effects on thrombus formation and biomarker expression.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro thrombus formation with disease-relevant arterial shear profiles.
- Provides translational biomarker data for continuity from discovery to preclinical validation.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on comprehensive thrombus profiling.
- Supports mechanistic studies of arterial thrombosis relevant to human pathology.
Pipeline & Workflow Integration
This assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies with translational biomarker validation for anti-thrombotic drug development.
- Discovery Biology: Quantifies biomechanical triggers and pathways of thrombogenesis for hypothesis testing and biological de-risking.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in a physiologically relevant context.
- Analytics: Generates seven-dimensional thrombus profiles, enabling robust statistical comparison across conditions and compounds.
- Translational Research: Aligns in vitro findings with disease-relevant arterial thrombosis mechanisms for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable microfluidic and imaging platform adaptable to diverse anti-thrombotic R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in anti-thrombotic target validation.
- Operational Value: Standardizes and scales multi-parametric thrombus analysis for cross-program comparability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of anti-thrombotic candidates based on comprehensive mechanistic data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, fluorescence imaging, and quantitative image analysis.
- Demands access to specialized instrumentation, including microfabrication and multi-channel fluorescence microscopy.
- Necessitates cross-team standardization of assay protocols and data analysis workflows.
- May require adaptation for different blood sources or disease models to ensure translational relevance.
- Dependent on robust statistical analysis to interpret multi-dimensional thrombus profiles.
