ميكروفلويديك تدفق الدوائر عن طريق الدم تم اعادة تشكيل لنموذج الإرقاء وصفائح الدم نقل في المختبر

الهدف العام من هذه التجربة هو تقليد نقل الصفائح الدموية في المختبر واختباره باستخدام الإرقاء على الكولاجين ، مع التدفق الهيدروديناميكي والفحص المجهري في الوقت الفعلي. يتم علاج المرضى الذين يعانون من قلة الصفيحات بمركزات الصفائح الدموية المخزنة. تهدف طريقتنا إلى المساعدة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تجلط الدم والإرقاء ، مع التركيز بشكل خاص على جودة ووظيفة مركزات الصفائح الدموية المخزنة.

تتمثل القيمة المضافة لهذه التقنية في أنها تحاكي تدفق الدم ، وبالتالي تأخذ في الاعتبار تأثيرات الريولوجيا على الخلايا والجزيئات الحيوية المشاركة. الطريقة الحالية تقيم ارتباط الصفائح الدموية بالكولاجين. ومع ذلك ، يمكن أيضا تطبيقه على الأنسجة اللاصقة الأخرى ، بما في ذلك لويحات تصلب الشرايين أو الخلايا البطانية أو بروتينات مصفوفة معينة مثل عامل فون ويلبراند والفيبرينوجين.

ابدأ بإعداد الرقاقة الحيوية. دوامة وتخفيف مخزون الكولاجين من واحد إلى 20 في محلول الجلوكوز متساوي التوتر من الشركة المصنعة إلى تركيز نهائي يبلغ 50 ميكروغرام لكل ملليلتر. بعد ذلك ، قم بإدخال 0.8 ميكرولتر في ممرات رقاقة حيوية جديدة يمكن التخلص منها.

املأ جميع الممرات على أحد طرفي الشريحة ، وقم بتمييزها كنهاية المخرج. ثم افحص الشريحة للتأكد من أن كل حارة مملوءة بمحلول 5/6 من الطريق ، وعدم وجود فقاعات هواء. بعد ذلك ، احتضن الرقاقة عند أربع درجات مئوية لمدة أربع ساعات أو طوال الليل في وعاء رطب ومغلق.

في وقت لاحق ، قم بحظر القنوات المشفرة عن طريق سحب المخزن المؤقت في الطرف الآخر من الممرات. ثم لكل حارة ، قم بقص أطوال 12 سم من الأنابيب ، وقم بإرفاق دبوس بكل طول من الأنابيب لجعلها قابلة للتوصيل بالرقاقة الحيوية. اشطف أطوال الأنبوب بالماء المقطر من حقنة وموصل

بعد ذلك ، قم بتشبعها بمخزن مؤقت مانع وإغلاقها في حاوية رطبة لمدة ساعة واحدة على الأقل. بعد ذلك ، قم بإعداد المضخة والمشعب. أولا ، اشطف المضخة والمشعب بالماء المقطر لإزالة أي فقاعات هواء.

بعد ذلك ، قم بإرفاق الرقاقة الحيوية بمرحلة المجهر الآلي. ضع أحد طرفي الأطوال في أنبوب سعة 1.5 مليلتر مملوء ب HBS ، ثم قم بتثبيتها بالطرف الآخر بمداخل الرقاقة الحيوية. ضع المسامير المتعددة في منافذ الرقاقة الحيوية.

ثم اشطف النظام باستخدام HBS باستخدام المضخة. وبالتالي ستتم إزالة أي مخزن مؤقت مانع متبقي أو كولاجين ضعيف الالتصاق. هذا يكمل استعدادات غرفة التدفق.

ابدأ بتجميع مجموعات الدم الحديثة من المتطوعين الأصحاء في أنبوب طرد مركزي مخروطي الشكل. قم بتدوير العينة لمدة 15 دقيقة عند 250 Gs.Do لا تستخدم الفرامل ، لأنها ستزعج المرحلة السفلية المعبأة بشكل فضفاض. قم بإزالة البلازما الغنية بالصفائح الدموية والطبقة المصفرية والتخلص منها.

احتفظ بخلايا الدم الحمراء المعبأة التي تحتوي على أقل عدد ممكن من الصفائح الدموية ، لصنع الدم المعاد تكوينه. الآن ، ابدأ في إذابة أربعة ملليلتر من البلازما من النوع AB عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق و 20 ثانية. وفي الوقت نفسه ، حدد الهيماتوكريت لخلايا الدم الحمراء المعبأة المحضرة باستخدام محلل أمراض الدم الآلي.

بعد ذلك ، حدد تركيز الصفائح الدموية لمركز الصفائح الدموية المحضر لبنك الدم لاستخدامه في إعادة تكوين الدم كله. احسب الأحجام المطلوبة لمليلتر واحد من الدم المعاد تكوينه بنسبة 40٪ هيماتوكريت و 250،000 صفيحة لكل ميكرولتر. الآن ، باستخدام طرف ماصة مقطوع ، انقل الحجم المطلوب من خلايا الدم الحمراء والبلازما وتركيز الصفائح الدموية إلى التركيز المطلوب ، والحجم النهائي البالغ مليلتر واحد.

امزج الدم المعاد تكوينه مع انعكاسات لطيفة ، وقم بإجراء تعداد دم كامل. بعد ذلك ، احصل على أنبوب طرد مركزي دقيق مجهز يحتوي على Calcein AM ، وأضف ملليلتر واحد من الدم المعاد تكوينه إليه. امزج الدم مع الصبغة باستخدام انعكاسات لطيفة.

ثم احتضان الدم المعاد تكوينه لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. في البرنامج ، حدد منطقة الاهتمام في ممر التروية. ركز على ألياف الكولاجين الملتصقة في الجزء السفلي من الممرات بتكبير 100x.

من الناحية المثالية ، استخدم تباين الطور أو تباين التداخل التفاضلي. اختر خيار تعيين Z الحالي لمناطق التجانب المحددة لإصلاح مواضع Z المحددة رقميا. يجب أن يكون التركيز البصري قبل التروية على الكولاجين المعدني ، ولكن هذا قد يكون صعبا.

البديل هو ضبط تركيز المجهر على الصفائح الدموية الأولية الملتصقة. الآن ، امزج العينات برفق وضعها بجوار الرقاقة الحيوية. ثم ضع الأنبوب المتصل بالممر المرصود في الدم المعاد تشكيله.

بعد ذلك ، باستخدام البرنامج الذي يتحكم في المضخة ، قم بتطبيق ضغط 50 داين لكل سنتيمتر مربع لنقل عينة الدم إلى الممر وبدء التجربة. أثناء التجربة ، سجل الصور كل 15 ثانية لمدة خمس دقائق. تحديد حركية نمو الجلطة باستخدام برنامج تحليل الصور.

في هذه الحالة ، يتم استخدام Zen 2012. ابدأ بفتح تحليل صورة المكون الإضافي لتحديد التغطية السطحية للصفائح الدموية. قم بتعيين عتبة التألق في علامة التبويب التحليل التفاعلية لتحديد شدة البكسل التي ترتبط بإشارة موجبة ، والتي قد تأتي من الصفائح الدموية اللاصقة.

بعد ذلك، استخدم إنشاء جداول لإنشاء جدول بيانات تلقائيا يحتوي على قائمة بمساحات الإشارات الموجبة لكل نقطة زمنية. احفظ جداول البيانات هذه بتنسيق XML ، وافتحها في برنامج جداول بيانات لمزيد من العمليات الحسابية. في كل نقطة زمنية، احسب إجمالي مساحات السطح للكائنات المحددة، وعبر عن هذه القيمة كنسبة مئوية من السطح المغطى.

بعد ذلك ، ارسم البيانات كدالة لوقت التروية ، واحسب المنحدر عن طريق الانحدار الخطي. هذا يصمم حركية نمو الجلطة لتلك الحالة التجريبية المعينة. تم نشر ثلاث عينات دم كامل متطابقة معاد تشكيلها في وقت واحد على الأسطح المطلية بالكولاجين.

نتج عن ذلك معامل تباين قدره 8.7٪ مما يشير إلى تباين مقبول داخل المقايسة وداخل المختبر لمقارنة الاختبار. تمت محاكاة نقل الدم عن طريق إعادة تكوين الدم بالمكون الناقص. تم إجراء العديد من عمليات إعادة التشكيل مع انخفاض تركيزات الصفائح الدموية.

كما هو متوقع ، أدى انخفاض عدد الصفائح الدموية إلى تقليل الالتصاق كدالة لوقت التروية. بعد ذلك ، تم التحقيق في تأثير انخفاض درجات الحرارة بعد جمع الدم وأثناء التروية. وجد أن الجلطة تتراكم بشكل أبطأ عندما يبرد الدم إلى درجة حرارة الغرفة.

بالمقارنة مع عينة تم الاحتفاظ بها عند 37 درجة مئوية طوال الدراسة. أثناء الدوران ، ترتبط الصفائح الدموية بمواقع إصابة الأوعية الدموية في ظروف الإجهاد المطلق للجدار المرتفع. كما هو متوقع ، أدى تغيير المعدل الهائل في غرف تدفق الموائع الدقيقة إلى تغيير الالتصاق الصفائح الدموية الكلي.

تغير هذه الظروف أيضا حركية نمو الجلطة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لدى المرء فهم جيد لكيفية إجراء تجارب غرفة تدفق الموائع الدقيقة باستخدام الدم المعاد تكوينه لاختبار جودة ووظيفة مركزات الصفائح الدموية المخزنة. يمكن القيام بهذه التقنية في غضون سبع ساعات تقريبا.

مهدت تجارب غرفة تدفق الموائع الدقيقة الطريق للباحثين في مجال نقل الصفائح الدموية لاستكشاف تأثير متغيرات التبرع والتحضير والتخزين. أحد الأمثلة ذات الصلة هو تعطيل مسببات الأمراض. لقد قدمنا مثالا لموضوع تجريبي واحد فقط.

ومع ذلك ، يمكن استخدام الاختلافات في تركيز الكالسيوم والإجهاد المطلق والطلاء السطحي لمعالجة أسئلة البحث المختلفة. على غرار هذا الإجراء ، يمكن إجراء قياسات أخرى في غرف تدفق الموائع الدقيقة للإجابة على أسئلة إضافية. على سبيل المثال أداء الصفائح الدموية المخزنة للتخثر على التدفق.