سير العمل كاملا لتحليل هيستون التعديلات بعد متعدية عن طريق أسفل إلى أعلى الطيف الكتلي: من هيستون استخراج لتحليل البيانات

الهدف العام لهذا البروتوكول هو توفير إجراء بسيط لتقييم الوفرة النسبية لتعديلات ما بعد الترجمة في الهيستون ، والتي تلعب أدوارا أساسية في بيولوجيا الكروماتين ، مثل تنظيم التعبير الجيني وتكثيف الكروموسومات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الكروماتين. مثل ، أي تعديلات هيستون تغير وفرة نسبية عند تحفيز أو علاج الخلايا أو الأنسجة المعينة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه باستخدام البروتينات القائمة على قياس الطيف الكتلي ، يمكننا في نفس الوقت تحديد معظم PTMs المعروفة على البروتينات المعروفة في تحليل واحد. تحليل تعديل الهيستون له العديد من التطبيقات ، بما في ذلك تقدير التغيرات اللاجينية وتشغيل الكروماتين للأفراد أو النظام النموذجي عند العلاج بالعقاقير أو الإجهاد. بالإضافة إلى سيمون ، سيوضح عضوان آخران في مختبري إجراءات هذا البروتوكول.

ناتاراجان بانو ، أخصائي أبحاث ، وكيلي كارش ، طالبة دراسات عليا. كما هو موضح في سير العمل هذا ، هذا بروتوكول مكون من 10 خطوات يتضمن تنقية الهيستون من مزارع الخلايا أو الأنسجة ، واشتقاق الهيستون ، والهضم وتحلية المياه ، وتحليل الطيف الكتلي باستخدام كروماتوغرافيا التدفق السائل النانوي. سيتم عرض الإجراءات المختارة فقط في هذا الفيديو.

لبدء إجراء عزل النوى عن الخلايا السليمة ، قم بإذابة الجليد ، الخلايا التي تم حصادها وتخزينها مسبقا عند سالب 80 درجة مئوية. وإعداد المخزن المؤقت للعزل النووي ، أو NIB ، كما هو موضح في نص البروتوكول. قم بإزالة خمس حجم NIB وأضف NP-40 البديل للتركيز النهائي بنسبة 0.2٪ سيتم استخدام الحجم الأربعة أخماس المتبقي للغسيل.

اغسل حبيبات الخلية باستخدام NIB بدون بديل NP-40, باستخدام نسبة 1:10 من حجم حبيبات الخلية إلى حجم المخزن المؤقت. جهاز طرد مركزي عند 700 RCF لمدة خمس دقائق وإزالة المادة الطافية. قم بتحويل حبيبات الخلية عن طريق وضعها على الجليد وإضافة NIB مع 0.2٪ NP-40 بديل بنسبة 1:10 من حجم حبيبات الخلية إلى حجم المخزن المؤقت.

تجانس الخلايا عن طريق سحب العينة اللطيف. احتضان الخلايا المتجانسة على الجليد لمدة خمس إلى 10 دقائق حتى تتحلل الخلايا وتطلق النوى. جهاز طرد مركزي عند 1000 RCF لمدة خمس إلى 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.

ستحتوي الحبيبات في الغالب على نوى خلية ، بينما تحتوي المادة الطافية في الغالب على مكونات سيتوبلازمية. احفظ الجزء السيتوبلازمي إذا رغبت في ذلك. اغسل حبيبات النوى عن طريق إعادة تعليقها برفق NIB بدون بديل NP-40, باستخدام نسبة 1:10 من حجم الحبيبات إلى حجم المخزن المؤقت.

جهاز طرد مركزي عند 1000 RCF لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، وقم بإزالة السوبرناتينت. بعد إزالة بديل NP-40 تماما من حبيبات النوى ، أضف حمض الكبريتيك المولي المثلج 0.2 بنسبة 1: 5 من حجم النوى إلى حجم حمض الكبريتيك. أعد تعليق النوى في حمض الكبريتيك عن طريق سحب العينة اللطيف.

احتضان العينة بدوران مستمر ، أو رج لطيف لمدة ساعتين إلى أربع ساعات عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 3400 RCF عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق ونقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد. جهاز الطرد المركزي مرة أخرى ونقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد لإزالة أي مادة غير قابلة للذوبان.

لترسيب الهستونات ، أضف حمض ثلاثي كلورو أسيتيك المبرد بنسبة 100٪ ، أو TCA ، إلى المادة الطافية المجمعة بنسبة حجم 1: 3. يشار إلى وجود الهستونات من خلال تحول العينة إلى غائم. امزج عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات.

احتضن الخليط على الثلج لمدة ساعة على الأقل. جهاز طرد مركزي عند 3400 RCF لمدة خمس دقائق. بعد الطرد المركزي ، ستغلف الهستونات جوانب الأنبوب وتترسب أيضا في الأسفل.

ستشكل حبيبات بيضاء غير قابلة للذوبان أيضا في الجزء السفلي من الأنبوب ، والتي تحتوي في الغالب على بروتينات غير هيستون وجزيئات حيوية أخرى. قم بإزالة المادة الطافية بعناية عن طريق الشفط ، دون كشط جوانب الأنبوب ، أو الحبيبات الموجودة في الجزء السفلي من الأنبوب. باستخدام ماصة باستور زجاجية ، اشطف الأنبوب باستخدام الأسيتون المثلج بنسبة 100٪ بالإضافة إلى حمض الهيدروكلوريك بنسبة 0.1٪ ، وذلك لتغطية البروتينات المترسبة التي تغطي الجوانب والقاع.

جهاز طرد مركزي عند 3400 RCF لمدة دقيقتين. استنشق المادة الطرافية بعناية ، دون كشط الجوانب أو الحبيبات. اشطف الأنبوب بالأسيتون المثلج بنسبة 100٪ ، وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى ، وقم بإزالة المادة الطافية دون كشط الجوانب أو الحبيبات.

بعد ذلك ، يتم إجراء القياس الكمي للهيستون وتحليل النقاء كما هو موضح في نص البروتوكول. يمكن أيضا إجراء تجزئة اختيارية لمتغيرات هيستون بواسطة HPLC في المرحلة العكسية قبل اشتقاق الهيستون. ابدأ هذا الإجراء بإذابة عينات الهيستون في 40 ميكرولتر من بيكربونات الأمونيوم 50 ملليمولر ، درجة الحموضة 8.0.

تحقق من الأس الهيدروجيني عن طريق إدخال طرف ماصة P10 في العينة دون الشفط، ولمس طرف الماصة بشريط مؤشر الأس الهيدروجيني. استخدم هيدروكسيد الأمونيوم وحمض الفورميك لضبط الرقم الهيدروجيني إلى 8.0. من الآن فصاعدا ، يجب تنفيذ جميع الخطوات التي تنطوي على استخدام أنهيدريد البروبيونيك في غطاء الدخان.

قم بمعالجة ثلاث إلى أربع عينات كحد أقصى في المرة الواحدة ، من أجل الحفاظ على تفاعل أنهيدريد البروبيونيك. قم بإعداد كاشف البروبيونيلاسیون الطازج عن طريق خلط أنهيدريد البروبيونيك مع الأسيتونيتريل في حصة حجم 1: 3. أضف كاشف البروبيونيل إلى كل عينة بنسبة حجم 1: 4.

أضف هيدروكسيد الأمونيوم بسرعة لإعادة إنشاء درجة الحموضة 8.0 إلى المحلول. عادة ما تكون إضافة هيدروكسيد الأمونيوم إلى العينة بنسبة حجم 1: 5 مناسبة لإعادة إنشاء درجة الحموضة 8.0. تخلط على الفور عن طريق الدوامة.

تحقق من الرقم الهيدروجيني. احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد أن تخضع جميع العينات للبروبيونيل ، جفف العينات حتى 10 إلى 20 ميكرولترا في مكثف فراغ.

أعد تعليق العينات أو تخفيفها باستخدام ddH20 حتى يتم تحقيق 40 ميكرولترا من الحجم النهائي. نظرا لأن الأملاح تعيق الكروماتوغرافيا السائلة وقياس الطيف الكتلي ، يجب تحلية العينات قبل التحليل. لأغراض هذا الفيديو ، سيتم عرض بناء نصائح المرحلة فقط.

استخدم طرف ماصة P1000 لكمة قرص من مادة C18 من قرص شفط الطور الصلب. استخدم شعيرات شعرية من السيليكا المنصهرة لدفع القرص الصغير خارج طرف P1000 إلى الجزء السفلي من طرف الماصة P100 أو P200. تأكد من تثبيت القرص بإحكام في الجزء السفلي من الطرف.

في حالة تحلية أكثر من 25 ميكروغراما من العينة ، استخدم قرصين صغيرين C18 في نفس طرف P100 أو P200. استخدم محول الطرد المركزي لتثبيت أطراف المرحلة في مكانها في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 أو ملليلتر. اغسل الراتنج عن طريق الدوران ب 50 ميكرولتر من الأسيتونيتريل 100٪ لتنشيط مادة C18 وإزالة الملوثات المحتملة.

يتم لاحقا إجراء تحلية العينة كما هو موضح في نص البروتوكول. توجد ببتيدات هيستون في مجموعة متنوعة من الأشكال متساوية الضغط. يتم عرض مثالين شائعين في تحليل الهيستون.

الكروماتوغرام الأيوني المستخرج لكتلة السلائف والنظائر النسبية ، كما هو موضح أعلاه ، متطابق. ومع ذلك ، فإن الكروماتوجرام الأيوني المستخرج لأيونات المنتج ، كما هو موضح أدناه ، يسمح بالتمييز بين الشكلين متساوي الضغط. يجب استخدام أيونات الشظايا الفريدة فقط ، المميزة باللون الأحمر ، لتقدير الوفرة النسبية للنوعين.

تم تحليل الهستونات المستخرجة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية ، مع أو بدون تحفيز حمض الريتينويك. كشف القياس الكمي النسبي لاثنين من ببتيدات هيستون H3 عن انخفاض واضح في الأستلة في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية ، المحفزة للتمايز. هذا يتوافق مع التقارير السابقة عن ارتفاع الأستلة في الخلايا الجذعية الجنينية ، مقارنة بالخلايا المتمايزة.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون ثلاثة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. يوم واحد لاستخراج الهيستون ، واليوم الثاني لاشتقاق البروتين وهضمه ، واليوم الثالث لاشتقاق الببتيد ، وانقلاب المرحلة وتحليل LC-MS. يمكن استغلال تنقية الهيستون لأغراض أخرى غير تحليل الببتيدات ، بما في ذلك البروتينات الوسطى إلى الأسفل ومن أعلى إلى أسفل ، حيث يمكن إضفاء الطابع المميز على تعديلات الهيستون التوافقية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد وقياس تعديل ما بعد الترجمة من الهيستون باستخدام البروتينات القائمة على قياس الطيف الكتلي.