سير العمل كاملا لتحليل هيستون التعديلات بعد متعدية عن طريق أسفل إلى أعلى الطيف الكتلي: من هيستون استخراج لتحليل البيانات

الهدف العام من هذا البروتوكول هو توفير إجراء بسيط لتقييم الوفرة النسبية لتعديلات الهيستون بعد الترجمة، والتي تلعب أدواراً أساسية في بيولوجيا الكروماتين، مثل تنظيم التعبير الجيني وتكثيف الكروموسومات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال بيولوجيا الكروماتين، مثل تحديد أي من تعديلات الهيستون يتغير وفرتها النسبية عند تحفيز أو معالجة خلايا أو أنسجة معينة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنه يمكننا، من خلال استخدام البروتوميات القائمة على قياس الطيف الكتلي، تقدير كمية معظم تعديلات ما بعد الترجمة (PTMs) المعروفة على البروتينات المعروفة في تحليل واحد وبشكل متزامن. ولتحليل تعديلات الهيستون تطبيقات عديدة، بما في ذلك تقدير التغيرات فوق الجينية وعمل الكروماتين لدى الأفراد أو في الأنظمة النموذجية عند التعرض للعلاج الدوائي أو الإجهاد. وبالإضافة إلى Simone، سيقوم عضوان آخران من مختبري بتوضيح إجراءات هذا البروتوكول.

ناتاراجان بانو، أخصائي أبحاث، وكيلي كارتش، طالبة دراسات عليا. كما هو موضح في مخطط سير العمل هذا، يتكون البروتوكول من 10 خطوات تشمل تنقية الهيستونات من المزارع الخلوية أو الأنسجة، واشتقاق الهيستونات، والهضم وإزالة الأملاح، وتحليل مطيافية الكتلة باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة ذات التدفق النانوي. سيتم استعراض إجراءات مختارة فقط في هذا الفيديو.

لبدء إجراء عزل النوى من الخلايا السليمة، قم بإذابة الخلايا التي تم حصادها وتخزينها مسبقاً عند درجة حرارة 80- درجة مئوية على الثلج. وقم بتحضير منظم عزل النوى، أو NIB، كما هو موضح في نص البروتوكول. اسحب خُمس حجم الـ NIB وأضف إليه NP-40 Alternative ليصل إلى تركيز نهائي قدره 0.2%، بينما سيتم استخدام الأربعة أخماس المتبقية من الحجم لعمليات الغسل.

اغسل كتلة الخلايا المترسبة باستخدام NIB بدون NP-40 Alternative، بنسبة 1:10 من حجم كتلة الخلايا إلى حجم المنظم. قم بالطرد المركزي عند 700 RCF لمدة خمس دقائق وأزل الطافي. قم بتحليل كتلة الخلايا المترسبة بوضعها على الثلج وإضافة NIB مع 0.2%NP-40 Alternative بنسبة 1:10 من حجم كتلة الخلايا إلى حجم المنظم.

قم بتجنيس الخلايا عن طريق السحب والضخ اللطيف باستخدام الماصة. قم بتحضين الخلايا المجنسة على الثلج لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق لتحلل الخلايا وتحرر النوى. قم بالطرد المركزي عند 1000 RCF لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C.

ستحتوي الراسبة بشكل أساسي على نوى الخلايا، بينما سيحتوي الطافي بشكل أساسي على المكونات السيتوبلازمية. يمكن حفظ الجزء السيتوبلازمي إذا رغبت في ذلك. اغسل راسبة النوى عن طريق إعادة تعليقها بلطف في NIB بدون NP-40 Alternative، باستخدام نسبة 1:10 من حجم الراسبة إلى حجم المنظم.

قم بالطرد المركزي عند 1000 RCF لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة أربع درجات مئوية، ثم تخلص من الراشح. بعد إزالة NP-40 Alternative تماماً من كتلة النوى المترسبة، أضف حمض الكبريتيك بتركيز 0.2 مولار المبرد على الثلج بنسبة 1:5 من حجم النوى إلى حجم حمض الكبريتيك. أعد تعليق النوى في حمض الكبريتيك عن طريق السحب والضخ اللطيف باستخدام الماصة.

يُحضن العينة مع التدوير المستمر، أو الرج اللطيف لمدة تتراوح من ساعتين إلى أربع ساعات عند درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، تُطرد العينة مركزياً عند 3400 RCF عند درجة حرارة 4 °C لمدة خمس دقائق، ثم يُنقل السائل الطافي إلى أنبوب جديد. تُكرر عملية الطرد المركزي ويُنقل السائل الطافي إلى أنبوب جديد لإزالة أي مواد غير ذائبة.

لترسيب الهيستونات، أضف حمض ثلاثي كلورو الأسيتيك (TCA) المبرد بتركيز 100% إلى السائل الطافي الذي تم جمعه بنسبة حجمية تبلغ 1:3. ويُستدل على وجود الهيستونات من خلال تحول العينة إلى الحالة العكرة. اخلط المزيج عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات.

يُحضن الخليط على الثلج لمدة ساعة واحدة على الأقل. ثم يُفصل بالطرد المركزي عند 3400 RCF لمدة خمس دقائق. بعد عملية الطرد المركزي، ستغلف الهيستونات جوانب الأنبوب وتترسب أيضًا في القاع.

ستتكون أيضاً كريّة بيضاء غير قابلة للذوبان في قاع الأنبوب تماماً، تحتوي غالباً على بروتينات غير هيستونية وجزيئات حيوية أخرى. قم بإزالة السائل الطافي بعناية عن طريق الشفط، دون كشط جوانب الأنبوب أو الكريّة الموجودة في قاعه. وباستخدام ماصة باستير زجاجية، اشطف الأنبوب بـ 100% أسيتون مبرد بالثلج بالإضافة إلى 0.1% حمض الهيدروكلوريك، بحيث يتم تغطية البروتينات المترسبة الملتصقة بالجوانب والقاع.

قم بالطرد المركزي عند 3400 RCF لمدة دقيقتين. اسحب السائل الطافي بعناية، دون كشط الجوانب أو الراسب. اشطف الأنبوب بـ 100% أسيتون مبرد بالثلج، ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى، وأزل السائل الطافي دون كشط الجوانب أو الراسب.

بعد ذلك، يتم إجراء قياس كمية الهيستون وتحليل النقاوة كما هو موضح في نص البروتوكول. ويمكن أيضاً إجراء تجزئة اختيارية لمتغيرات الهيستون باستخدام HPLC ذات الطور المعكوس قبل اشتقاق الهيستون. ابدأ هذا الإجراء بإذابة عينات الهيستون في 40 µL من بيكربونات الأمونيوم بتركيز 50 mM، وبقيمة pH 8.0.

تحقق من قيمة الـ pH عن طريق إدخال رأس ماصة P10 في العينة دون سحب السائل، ولمس رأس الماصة بشريط مؤشر pH. استخدم هيدروكسيد الأمونيوم وحمض الفورميك لضبط الـ pH عند 8.0. من هذه النقطة فصاعداً، يجب تنفيذ جميع الخطوات التي تتضمن استخدام أنهيدريد البروبيونيك داخل خزانة استخلاص الغازات.

قم بمعالجة ثلاث إلى أربع عينات كحد أقصى في المرة الواحدة، وذلك للحفاظ على نشاط أنهيدريد البروبيونيك. قم بتحضير كاشف البروبيونيل freshly عن طريق خلط أنهيدريد البروبيونيك مع الأسيتونيتريل بنسبة حجمية تبلغ 1:3. أضف كاشف البروبيونيل إلى كل عينة بنسبة حجمية تبلغ 1:4.

أضف هيدروكسيد الأمونيوم بسرعة لإعادة ضبط الرقم الهيدروجيني (pH 8.0) للمحلول. وعادةً ما يكون إضافة هيدروكسيد الأمونيوم إلى العينة بنسبة حجمية 1:5 مناسباً لإعادة ضبط الرقم الهيدروجيني (pH 8.0). اخلط المزيج فوراً باستخدام جهاز الرج الدوامي (vortexing).

افحص قيمة الـ pH. قم بتحضين العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. وبعد إتمام عملية البروبيونيلة (propionylation) لجميع العينات، جفف العينات حتى تصل إلى 10 إلى 20 µL باستخدام مركز تفريغ (vacuum concentrator).

أعد تعليق العينات أو خففها باستخدام ddH20 حتى يتم الوصول إلى حجم نهائي قدره 40 microliters. ونظراً لأن الأملاح تعيق الكروماتوغرافيا السائلة ومطيافية الكتلة، يجب إزالة الأملاح من العينات قبل التحليل. ولأغراض هذا الفيديو، سيتم عرض طريقة تحضير رؤوس الاستخلاص (stage-tips) فقط.

استخدم رأس ماصة P1000 لثقب قرص من مادة C18 من قرص استخلاص الطور الصلب. استخدم شعيرة من السيليكا المصهورة لدفع القرص الصغير خارج رأس ماصة P1000 وإلى قاع رأس ماصة P100 أو P200. تأكد من أن القرص مثبت بإحكام في قاع رأس الماصة.

في حالة إزالة الأملاح من عينة تزيد كميتها عن 25 ميكروغرام، استخدم قرصين صغيرين من نوع C18 في نفس رأس الماصة P100 أو P200. استخدم مهايئ طرد مركزي لتثبيت رؤوس المرحلة في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 أو 2 ملليلتر. قم بغسل الراتنج عن طريق الدوران باستخدام 50 ميكرولتر من 100% acetonitrile لتنشيط مادة C18 وإزالة الملوثات المحتملة.

يتم إجراء إزالة الأملاح من العينة لاحقاً كما هو موضح في نص البروتوكول. وتتواجد ببتيدات الهيستون في مجموعة متنوعة من الأشكال المتساوية الكتلة (isobaric). وقد تم عرض مثالين شائعين بكثرة في تحليل الهيستون.

إن الكروماتوغرام الأيوني المستخلص لكتلة السلف والنظائر النسبية، الموضح أعلاه، متطابق. ومع ذلك، فإن الكروماتوغرام الأيوني المستخلص للأيونات الناتجة، الموضح أدناه، يسمح بالتمييز بين الشكلين متساويي الكتلة. يجب استخدام أيونات الشظايا الفريدة فقط، والمحددة باللون الأحمر، لتقدير الوفرة النسبية للنوعين.

تم تحليل الهيستونات المستخلصة من خلايا جذعية جنينية بشرية، مع وبدون تحفيز بحمض الريتينويك. وكشف التحديد الكمي النسبي لبيبتيدين من الهيستون H3 عن انخفاض واضح في عملية الأستلة في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية التي تم تحفيزها للتمايز. وهذا يتوافق مع التقارير السابقة التي أشارت إلى وجود مستويات أعلى من الأستلة في الخلايا الجذعية الجنينية مقارنة بالخلايا المتمايزة.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في ثلاثة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح؛ حيث يُخصص اليوم الأول لاستخلاص الهيستونات، واليوم الثاني لاشتقاق البروتين وهضمه، واليوم الثالث لاشتقاق الببتيدات، والتقنية الطرفية (stage-tipping)، وتحليل LC-MS. ويمكن الاستفادة من تنقية الهيستونات لأغراض أخرى غير تحليل الببتيدات، بما في ذلك البروتيوميات من النوع middle-down وtop-down، حيث يمكن توصيف التعديلات التوليفية للهيستونات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد وقياس التعديلات ما بعد الترجمية للهيستون باستخدام البروتيوميات القائمة على مطيافية الكتلة.