التصور والتحليل الكمي لتنشيط PARP1/PARP2 الناتج عن السموم الجينية في الخلايا باستخدام مراسل بروتين الاندماج الفلوري

يدرس مختبرنا مسارات إصلاح الحمض النووي المعتمدة على PARP1 وPARP2 والاستجابة لتلف الحمض النووي في الخلايا الطبيعية والمتحولة. التحدي في هذا المجال هو التحليل الكمي لتنشيط PARP1 وPARP2 في الخلايا مع تجنب تحلل الخلية. وهذا يسمح بإجراء دراسات تحديد المواقع تحت الخلية.

للبدء، أضف 375 ميكرولتر من مصل الأبقار الجنيني وDMEM الخالي من البنسلين-ستربتوميسين إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم بسعة 1.5 ملليتر. ثم أضف 10 ميكرولترات من مادة التحويل الدهنية وجميع البلازميدات المطلوبة إلى الأنبوب. انقر بلطف على أنبوب الطرد المركزي الدقيق لخلط الوسط، وكاشف النقل، وحمض البلازميد.

حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 إلى 30 دقيقة للسماح بتكوين مركب الحمض النووي وكاشف النقل. بعد ذلك، أضف خليط البلازميد وكاشف النقل بشكل قطري إلى الطبق بقطر 60 ملم الذي يحتوي على الخلايا المزروعة بقطر 293 قدم دون إزالة الوسط وإعادة الخلايا إلى الحاضنة لمدة 48 ساعة. ثم اجمع وسط الزراعة من الخلايا التي تم تحويلها بحجم 293 قدم.

لعزل جزيئات اللينتيفيروس، قم بترشيح الوسط المجمع عبر فلتر معقم بحجم 0.45 ميكرومتر لفصل حطام الخلايا عن جزيئات اللينتيفيروسات. للتحويل، احصل على الخلايا المطلوبة التي زرعت لمدة 24 ساعة وتحقق من أن التقاء الخلايا بين 20٪ و40٪. بعد ذلك، أضف ملليلتر واحد من الفيروس، وملليلتر واحد من وسط النمو، واثنين ميكرولتر من بوليبرين إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 ملليتر، مختلطا بلطف عن طريق العكس. الآن، أزل وسط النمو من صفيحة الستة آبار.

أضف خليط الفيروس والمتوسط وخليط بوليبرين إلى كل بئر. ضع الخلايا التي تحتوي على خليط النقل في حاضنة تحتوي على غلاف جوي رطب عند درجة حرارة 32 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 16 إلى 18 ساعة. للتحقق من تعبير حمض الأمين RNF146، من 100 إلى 182 EGFP، وزرع 200,000 خلية معبرة عن LivePAR لكل طبق زراعة يحتوي على شرائح تغطية.

اترك الخلايا من 24 إلى 36 ساعة تلتصق بشرائح التغطية، وتكييف الوسط، وابدأ في التكاثر. ثم تعرض الخلايا التي تعبر عن LivePAR للكواشف المعطاة. أضف المركبات مباشرة إلى الوسط الذي يحتوي على الخلايا على شرائح الغطاء ولف الوسط بلطف في أطباق زراعة الخلايا لتوزيع المركبات.

حضن الصحون بحجم 60 ملم على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 60 إلى 90 دقيقة. لتثبيت الخلايا، قم بإزالة الوسط وغسل الخلايا ب PBS. ضع الخلايا في 4٪ فورمالديهايد في PBS لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد إزالة الفورمالديهايد، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS. ثم أضف ثلاثة ملليلتر من الميثانول البارد والأسيتون إلى الخلايا بنسبة 7:3 لتثبيتها. ضع الصحون عند ناقص 20 درجة مئوية لمدة تسع دقائق.

ثم أزل محلول الميثانول الأسيتون. بعد غسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS، قم بعمل 15 ميكرولتر من وسط مضاد التزميل يحتوي على DAPI على شريحة زجاجية. ثبت غطاء الغطاء بلطف على وسط التثبيت بحيث تكون الخلايا متجهة للداخل، مع تقليل الفقاعات.

قم بتمركز وتثبيت الغطاء على شريحة الزجاج وأغلق الجوانب بوضع كمية صغيرة من طلاء الأظافر الشفافة على الحواف. ضع الشرائح في الظلام لتجف مينا الظفر. بعد تنزيل وتثبيت Image J، افتح Image J وثبت ملف الماكرو النصي LivePAR_Macro عن طريق النقر على الإضافات، اختيار الماكرو، واختيار التثبيت.

افتح جميع ملفات الكونفوكال في Image J واحفظ الملفات كملفات TIFF للحفاظ على الملفات الأصلية. ثم افتح مستند جدول بيانات واحفظه Date_CellLineFociAnalysis. حلل ملف TIFF واحد في كل مرة.

اضغط 1 للعثور على النوى. عند فتح نافذة مدير العائد على الاستثمار، اختر جميع الإدخالات واضغط على Add لتغطية منطقة النوى فوق الصورة الأصلية. احذف النوى التي تم تحديدها بشكل خاطئ واستبعد النوى التي ليست ضمن الإطار بالكامل.

ثم ارسم النواة باستخدام أداة الاختيار الحر واضغط على 2 لقياس تركيزات PAR. اختر كل نواة في مدير العائد على الاستثمار وعد عدد البؤر لكل نواة. انسخ ولصق البيانات الكمية في مستند الجدول المفتوح بعد تقييم جميع النوى في الملف.

وبالمثل، كرر التحليل لجميع ملفات TIFF. عند الانتهاء، رسم تركيزات PAR لكل نواة في البرنامج المختار. أظهرت خلايا التحكم في المركبات تصبغات EGFP في الخلايا الداخلية.

أظهرت الخلايا المعالجة بالجينوتوكسين تراكما لبؤر نووية تمثل التمركز داخل النواة. أدى العلاج المسبق بمثبط PARP1 وPARP2 فيليباريب إلى فقدان بؤر PAR. أظهر قياس عدد بؤر PAR لكل نواة كدالة للوقت وظروف العلاج نتائج مماثلة.

يتيح لنا هذا البروتوكول قياس تنشيط محور الإشارة PARP1 وPARP2 استجابة للسموم الجينية والتغيرات الجينية التالية. لقد استخدمنا تقنيات الفلورة المناعية التقليدية مع هذا الاختبار للتحقق من التزامن مع البروتينات باستخدام بولي ADP-ريبوز. في المستقبل، نستخدم هذا الاختبار لاختبار السمية الجينية لتحليل عالي الإنتاجية لمثبطات PARP1 أو PARP2 أو PARP، ولتحديد العوامل الجديدة المشاركة في إشارات PARP1 وPARP2.