طريقة فعالة وسريعة من نوع HPLC-QQQ-MS لقياس كمية قلويدات التروبان في النباتات الطبية

طورنا طريقة HPLC-QQQ-MS لقياس ثلاثة قلويدات تروبان رئيسية بسرعة في Anisodus tanguticus. تفتقر HPLC التقليدية إلى حساسية تجاه قلويدات التروبان. تستخدم هذه الطريقة مطيافية الكتلة عالية الحساسية لحل هذه المشكلة.

للبدء، قم بوزن 10.0 ملليغرام من معايير مرجعية للهيدروبروميد الهيوسيامين، وأنيسودامين، وهيدروبروميد السكوبولامين. ضعها في قارورة حجمية منفصلة بسعة 10 ملليلتر. أضف الميثانول بدرجة كروماتوغرافية إلى الخط المحدد في كل قارورة حجمية.

قم بإذابة المعايير جيدا باستخدام العلاج بالموجات فوق الصوتية لتحضير محاليل قياسية واحدة بتركيز 1.0 ملليغرام لكل ملليتر. ثم انقل المحاليل الأصلية إلى زجاجات كاشف بنية وخزنها في درجة حرارة أربع درجات مئوية في الظلام. لتحضير محلول متوسط متوسط مختلط بحجم 10 ميكروغرام لكل ملليلتر، قم بإدخال 100 ميكرولتر من كل محلول مخزون تم تحضيره مسبقا في قارورة حجمية بحجم 10 ملليتر.

ثم أضف ميثانول بدرجة كروماتوغرافية إلى الخط المحدد لتخفيف المحلول. بعد ذلك، قم بتجفيف مادة سوفورا فلافيسنس الطازجة بالتجميد. ثم، باستخدام مطحنة عالية السرعة، قم بسحق المادة المجففة إلى مسحوق متجانس.

قم بغربلة المسحوق عبر منخل اختبار قياسي بقطر 0.25 ملم. وزن بدقة 20 ملليغرام من المسحوق المنخل. انقله إلى قارورة حجمية بسعة 100 ملليلتر وأضف ميثانول بدرجة كروماتوغرافية إلى أسفل الخط المحدد مباشرة.

بعد ذلك، قم بإجراء استخراج بالموجات فوق الصوتية في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. ثم أزل القارورة الحجمية ودعها تبرد إلى 25 درجة مئوية في درجة حرارة الغرفة. أضف ميثانول بدرجة كروماتوغرافية إلى الخط المحدد بحجم 100 ملليلتر والدوامة لخلط لمدة دقيقتين.

ثم قم بتعبئة ماصة واحدة من الملليلتر من المستخلص المحضر في قارورة حجمية بسعة 100 ملليتر. أضف الميثانول إلى الخط المميز. اهز جيدا لتخلط جيدا واحصل على المحلول الأم لحقن HPLC.

لترشيح العينة، حضر حقنة بدون إبر بسعة ملليلتر واحد وغشاء دقيق مسامي بقطر 0.22 ميكرومتر من الطور العضوي. استنشق 1.2 ملليلتر من المحلول الأم للحقن في الحقنة وترشيح المحلول بدفعه ببطء عبر الغشاء. اجمع الفلترة في قارورة عينة سعة ملليتر مع إدخال داخلي وأغلق القارورة بإحكام بغطاء.

جهز المرحلة المتحركة A بقياس 1000 ملليلتر من الماء فائق النقي. أضف 1.0 ملليلتر من حمض الفورميك بدرجة كروماتوغرافية وامزج بشكل موحد باستخدام محرك مغناطيسي لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، جهز المرحلة المتنقلة B باستخدام ميثانول بدرجة كروماتوغرافية مباشرة دون معالجة إضافية.

تقوم بإزالة الغازات المتحركة للطور A وB عند 40 كيلوهرتز لمدة 15 دقيقة باستخدام وحدات إزالة غازات منفصلة بالموجات فوق الصوتية. ربط المراحل المتنقلة التي تم إزالة الغازات في زجاجات مذيبات منفصلة بخطوط A و B المقابلة لنظام HPLC. استخدم عمود C18 للفصل الكروماتوغرافي.

توازن العمود مع الميثانول والماء بنسبة 80 إلى 20 لمدة 30 دقيقة بمعدل تدفق 0.3 ملليلتر في الدقيقة. اضبط درجة حرارة فرن العمود على 30 درجة مئوية وسخن مسبقا لمدة 10 دقائق مسبقا. ثم ضبط معدل التدفق إلى 0.60 ملليلتر في الدقيقة، وحجم الحقن إلى ميكرولترين، وطول موجة الكشف إلى 210 نانومتر.

بعد ذلك، قم بتعيين برنامج التوتر التدرج مع الشروط المعروضة. إجراء الكشف الطيفي الكتلي باستخدام مطياف كتلة ثلاثي رباعي الأقطاب مزود بمصدر تأين كهربائي يعمل في وضع التأين الإيجابي. اضبط ضغط جهاز التنشاخ إلى 15 رطلا لكل بوصة مربعة، جهد الشعيرات الدموية على 4,000 فولت، درجة حرارة الغاز إلى 300 درجة مئوية، وتدفق الغاز إلى 11 لترا في الدقيقة.

ثم اضبط المعلمات لأزواج أيونات مراقبة تفاعلية متعددة. لتحديد الأيونات السابقة، قم بحقن المحاليل القياسية الفردية مباشرة في وضع المسح MS2. بعد التحقق من الطريقة، قم بجمع البيانات في وضع مراقبة تفاعلات متعددة.

استخدم المعلمات المحسنة، بما في ذلك الأيونات السابقة، وانتقالات أيونات الناتجة، وجهد الشظايا، وطاقة التصادم لكل محلل كما هو موضح هنا. أطلق برنامج التحليل النوعي. اختر الملف واختر استيراد البيانات لاستيراد جميع ملفات البيانات المجمعة.

تحقق من تناظر الذروة ووقت الاحتفاظ بقوام القمم المستهدفة في كل كروماتوجرام أيوني مستخرج. في وحدة الكمية، اختر انتقال MRM. إدخال أزواج الأيونات الأولية والأيونات الناتجة لكل مكون واستخراج كروماتوغرامات الأيونات المستخرجة المقابلة.

احسب مساحة الذروة للتحليل الكمي. تم فصل جميع قلويدات التروبان الثلاثة المستهدفة بنجاح خلال 20 دقيقة تحت ظروف HPLC المثلى. كانت الدقة بين سكوبولامين وأنيسودامين 8.67.

بينما وصلت القيم بين أنيسودامين والهيوسيامين إلى 11.58، تجاوزت جميع قيم الدقة بشكل ملحوظ معيار الانفصال الأساسي 1.5. أظهرت جميع المحللات خطية جيدة على نطاق تركيز يتراوح بين 0.014 إلى 0.320 ميكروغرام لكل ملليلتر مع معاملات ارتباط أكبر من 0.99. كان متوسط التعافي 101.44٪ للسكوبولامين، و100.25٪ لأنيسودامين، و99.56٪ للهيوسيامين، مع انحرافات معيارية نسبية بلغت 1.85٪ و2.35٪ و1.9٪ على التوالي.

أظهر قياس ثلاثة قلويدات تروبان في 10 عينات من Anisodus tanguticus أن محتوى السكوبولامين تراوح من 0.3667 ملليغرام لكل جرام في العينة السادسة إلى 1.0356 ملليغرام لكل غرام في العينة السابعة. تراوحت نسبة الأنيسودامين من 0.0269 ملليغرام لكل جرام في العينة السادسة إلى 0.3590 ملليغرام لكل جرام في العينة 10. تراوحت نسبة الهيوسكامين من 0.2930 ملليغرام لكل جرام في العينة الثانية إلى 1.4989 ملليغرام لكل جرام في العينة 10، مع لوحظات مستويات أعلى في العينات 4 و7 و9 و10.

يتيح هذا البروتوكول قياسا دقيقا وسريعا لثلاثة قلويدات تروبان رئيسية. التحدي الرئيسي هو ضمان إجراءات الأجهزة وتحضير العينات بشكل موحد للقياس الدقيق. يمكن توسيع هذه الطريقة لاستكشاف وقياس المستقلبات الأخرى في Anisodus tanguticus.