高性能液相色谱法 (HPLC)

高效液相色谱 （HPLC） 是一种用途广泛的技术，可根据液体混合物与固定相的不同相互作用来分离液体混合物的成分。

HPLC 是柱色谱法的变体。在柱层析中，层析柱填充有称为固定相的微量珠子。固定相磁珠通过化学基团功能化，这些化学基团诱导磁珠与位于液体或流动相中的混合物组分之间发生相互作用。当混合物流经色谱柱时，组分与固定相的相互作用不同。

在 HPLC 中，柱色谱法在更高的流速下进行，因此比传统柱色谱法具有更高的压力。这使得可以使用具有更大表面积体积比的更小的固定相微珠，从而大大增加了固定相与流动相中组分的相互作用。

本视频将通过演示各种无糖苏打水的成分分离来介绍 HPLC作的基础知识。

实验室使用两种类型的 HPLC：分析型和制备型。在分析 HPLC 中，该仪器用于识别小体积组分，然后将分析的样品作为废液丢弃。在制备型 HPLC 中，该仪器用于纯化混合物，并以馏分形式收集所需量的每种组分。

HPLC 仪器由一系列简单的组件组成。首先，保存在溶剂储液槽中的流动相由一个或多个泵以恒定流速泵送至系统。样品由样品进样器注入流动相流中。然后，用流动相稀释的样品被输送到 HPLC 色谱柱，在那里分离样品的成分。然后由检测器分析组分，并分馏保存以备后用，或转移到废液瓶中。

HPLC 色谱柱是该系统的关键组件。它由金属或塑料圆柱体组成，填充有微量固定相或层析填料珠。样品混合物以恒定的流速流过填充的颗粒床，并且每种组分在流过时都会与固定相相互作用。

化合物与固定相的相互作用方式不同，因此沿色谱柱沿长度向下移动至检测器的速率不同。组分退出色谱柱或洗脱所需的时间称为保留时间。结果是保留时间与强度的关系图或色谱图。保留时间用于识别组分。峰大小（特别是峰下的面积）用于定量初始溶液中化合物的量。

固定相的选择取决于样品混合物中组分的性质。最常用的固定相是二氧化硅珠，因为它们是一种惰性非极性材料，可形成微尺度珠，并达到足够的堆积密度。最常见的 HPLC 类型是反相色谱法，它利用疏水性固定相，通常是带有 C18 链键合到珠子表面的二氧化硅珠。组分按极性递减的顺序洗脱。

反相色谱中使用的流动相通常是水和有机溶剂（如乙腈）的混合物。根据样品的不同，流动相可以保持水和有机溶剂的恒定比例，称为等度模式。然而，这可能会导致在高含水量的情况下出现宽峰，或者在有机物含量高的情况下产生重叠的峰。

在分离过程中，流动相比率也可以线性或逐步改变，以产生流动相梯度。梯度洗脱可以防止极性较弱组分的峰展宽，从而改善分离并缩短洗脱时间。

现在，已经概述了 HPLC 的基础知识，将在实验室中演示 HPLC 技术。在本实验中，HPLC 将用于分离和量化无糖苏打水的三种常见成分。

首先，为了制备流动相，将 400 mL 乙腈添加到 1.5 L 纯化去离子水中。然后小心加入 2.4 mL 冰醋酸。将溶液稀释至总体积为 2 L。所得溶液的 pH 值应介于 2.8 和 3.2 之间。

使用校准的 pH 计，向搅拌溶液中逐滴添加 40% NaOH，将 pH 调节至 4.2。

在真空下通过 0.47-？m 膜过滤器过滤流动相，以对溶液进行脱气并去除可能堵塞色谱柱的固体。对溶液进行脱气很重要，因为气泡会导致固定相中出现空隙，或者进入检测器池并导致测量不稳定。

准备咖啡因、苯甲酸盐和阿斯巴甜的三种成分溶液，这是无糖苏打水的三种典型成分。然后使用这些组分溶液制备用于确定未知物的标准溶液。准备 500 mL 咖啡因和苯甲酸盐溶液。

准备 100 mL 的阿斯巴甜成分溶液。不使用时将溶液存放在冰箱中，以免分解。

接下来，准备 7 种标准溶液，每种溶液含有不同浓度的咖啡因、苯甲酸盐和阿斯巴甜。将适量的每种组分移液到容量瓶中，然后用流动相稀释至 50 mL 标记。

前 3 种溶液各包含一个组分，以便进行峰鉴定。其他 4 种溶液包含所有 3 种组分的浓度范围，以便将峰高与浓度相关联。

将每种标准溶液倒入样品架中带标签的小瓶中。将装有样品和剩余溶液的样品架存放在冰箱中。

首先，设置流动相和废液容器。确保将废液管路送入废液容器中，并且不会循环回流动相中。确保将入口流动相管路送入流动相容器中。

验证流动相的流速是否设置为 0.5 mL/min。该流速将使所有组分能够在 5 min 内洗脱，但速度足够慢，无法确保分离单个峰。

接下来，验证溶剂输送系统上的最小和最大压力。这些设置分别在发生泄漏或堵塞时关闭泵。

按探测器前面板上的"零"，设置空白。冲洗 100-？L 注射器加入去离子水，然后加入 7 个工作标准品中 1 个的几个体积。然后将该溶液填充注射器。从 3 个单组分样品开始，以识别每个组分的峰。

接下来，通过将进样器手柄置于加载位置，手动进样溶液。慢慢注入 100 ？L 溶液通过隔膜端口。

验证数据收集程序是否设置为收集 300 秒的数据，以便有足够的时间让所有 3 个峰通过检测器洗脱。准备开始试验时，将进样器手柄旋转到进样位置，以便将样品进样到流动相中。立即在数据收集程序上单击"开始试用"。扫描完成后，对 7 种标准解决方案中的每一种重复该过程。对于前 3 个标准品中的每一个，只显示 3 个峰中的一个。记下峰的位置，该位置用于标识组件。

选择 3 个无糖苏打水样品，让它们在敞开的容器中放置过夜以去除碳酸化。

脱气过夜后，将大约 3 mL 的每种无糖苏打水吸入塑料注射器中。接下来，将过滤器尖端连接到注射器上，将苏打水通过过滤器推入玻璃瓶中，以去除任何固体颗粒。

用 2 mL 流动相稀释每个样品 2 mL，使苏打浓度降低一半。

第 100 期 ？L 中将其中一个苏打样品放入注射器中，然后将其注入样品定量环中。使用与标准解决方案相同的参数运行试验。对每个苏打水样品重复上述步骤。

首先，将标准样品的峰面积与已知浓度相关联。为此，使用三角法测定每个标准样品在色谱仪上的峰面积。计算峰高乘以宽度为高度的一半，并将该值用作峰面积。

使用峰面积和已知浓度为每个组分创建校准曲线，并确定每个校准曲线的最小二乘拟合。

根据峰面积计算无糖苏打水中每种成分的浓度。请记住，苏打水在注入 HPLC 之前都被稀释了 2 倍。根据这些结果，计算一罐 12 盎司苏打水中每种成分的毫克数。

不出所料，所有测试的 3 种苏打水都含有大致相同量的防腐剂苯甲酸盐。然而，可口可乐产品含有更多的咖啡因。所有组件的计算值与制造商报告的值非常相关。

HPLC 是一种用途广泛的仪器，可用于广泛的分析。

HPLC 通常用于纯化肽分子。在这个例子中，制备了跨膜肽复合物，然后通过用二硫键氧化交联蛋白质来稳定。

然后将蛋白质溶解在甲酸中，并使用反相 HPLC 纯化。然后使用两种溶剂的线性梯度洗脱样品，并通过质谱法确认纯度。

HPLC 还可用于鉴定实验室合成的有机化合物。在 Miller-Urey 实验中，研究了原始地球上有机化合物的非生物合成。原始气体，如甲烷和氨，被引入一个装有水的烧瓶中，模拟早期的海洋。然后施加放电，模拟原始地球上的闪电。

然后使用 HPLC 与质谱联用分析水，并与已知的氨基酸标准品进行比较。本实验合成并鉴定了 23 个氨基酸。

您刚刚观看了 JoVE 的 HPLC 简介。现在，您应该了解运行仪器和分析结果数据的基础知识。

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