高效液相色谱法（HPLC）

高效液相色谱法（HPLC）是一种高度通用的技术，可根据混合物中各组分与固定相之间的不同相互作用，对液体混合物中的成分进行分离。

高效液相色谱法（HPLC）是柱色谱的一种改进形式。在柱色谱中，色谱柱内填充有微米级的珠状颗粒，称为固定相。这些固定相颗粒表面修饰有特定的化学基团，能够与流动在液体（即流动相）中的混合物各组分发生相互作用。当混合物流经色谱柱时，各组分与固定相之间的相互作用程度各不相同。

在高效液相色谱（HPLC）中，柱色谱的流速较高，因此压力也高于经典柱色谱。这使得可以使用粒径更小的固定相颗粒，其表面积与体积之比更大，从而显著增强固定相与流动相中各组分之间的相互作用。

本视频将通过演示多种无糖软饮料中各组分的分离，介绍高效液相色谱（HPLC）操作的基本原理。

实验室中使用的高效液相色谱（HPLC）有两种类型：分析型和制备型。在分析型HPLC中，仪器用于鉴定小体积样品中的组分，分析后的样品作为废液被丢弃。在制备型HPLC中，仪器用于纯化混合物，并以组分分段收集的方式回收所需数量的各组分。

高效液相色谱仪由一系列简单的组件构成。首先，储存在溶剂储液瓶中的流动相通过一个或多个泵以恒定流速泵入系统。样品通过进样器注入流动相流路中。样品被流动相稀释后，被输送至高效液相色谱柱，在色谱柱中样品的各组分得以分离。随后，各组分由检测器进行分析，可选择收集为馏分以供后续使用，或转移至废液瓶中。

高效液相色谱柱是该系统的关键组件。它由一个金属或塑料制成的圆筒构成，内部填充有固定相的微米级微珠，即色谱树脂。样品混合物以恒定流速流经填充的颗粒床，各组分在流动过程中与固定相发生相互作用。

不同化合物与固定相的相互作用不同，因此它们以不同的速率沿色谱柱移动至检测器。组分从色谱柱中流出（即洗脱）所需的时间称为保留时间。结果得到一张保留时间与信号强度的关系图，即色谱图。保留时间用于鉴定组分；峰的大小，特别是峰面积，用于定量初始溶液中该化合物的含量。

固定相的选择取决于样品混合物中各组分的性质。最常用的固定相是硅胶微球，因为这种材料具有惰性且为非极性，能够形成微米级小球，并实现足够的填充密度。最常见的一种高效液相色谱是反相色谱，它采用疏水性固定相，通常是表面键合有C18链的硅胶微球。组分按极性由高到低的顺序依次洗脱。

反相色谱中使用的流动相通常是水与有机溶剂（如乙腈）的混合物。根据样品的不同，流动相可以保持水与有机溶剂的恒定比例，称为等度洗脱模式。然而，这可能导致在高水含量情况下出现峰展宽，或在高有机含量情况下出现峰重叠。

在分离过程中，流动相的比例也可以线性或阶梯式改变，以形成流动相梯度。梯度洗脱可防止极性较弱组分的峰展宽，从而改善分离效果并缩短洗脱时间。

在概述了高效液相色谱（HPLC）的基本原理之后，接下来将在实验室中演示该技术。本实验将利用高效液相色谱法分离并定量分析饮食型苏打饮料中的三种常见成分。

首先，配制流动相：将400 mL乙腈加入1.5 L纯化去离子水中，然后小心加入2.4 mL冰醋酸，加水稀释至总体积为2 L。所得溶液的pH值应在2.8至3.2之间。

使用校准的 pH 计，在搅拌溶液中逐滴加入 40% NaOH，将 pH 调至 4.2。

在真空条件下，使用 0.47-µm 的膜过滤器过滤流动相，以脱气并去除可能堵塞色谱柱的固体颗粒。脱气至关重要，因为气泡可能导致固定相中产生空隙，或进入检测器池，引起测量信号的不稳定。

配制咖啡因、苯甲酸盐和阿斯巴甜三种组分溶液，这三种成分是无糖软饮料中的典型组分。这些组分溶液随后用于制备标准溶液，以用于测定未知样品。分别配制 500 mL 的咖啡因和苯甲酸盐溶液。

配制 100 mL 的阿斯巴甜组分溶液。不使用时将溶液储存于冰箱中，以避免分解。

接下来，配制7种标准溶液，每种溶液含有不同浓度的咖啡因、苯甲酸盐和阿斯巴甜。将各组分的适当体积移取至容量瓶中，并用流动相稀释至50 mL刻度线。

前3种溶液各自含有一种组分，以实现峰的鉴定。其余4种溶液则含有3种组分的多种浓度，用于关联峰高与浓度之间的关系。

将每种标准溶液分别倒入已标记的样品瓶中，并置于样品架上。将装有样品和剩余溶液的样品架存放在冰箱中。

首先，设置流动相和废液容器。确保废液管路通入废液容器中，且不会回流至流动相中。确保流动相入口管路插入流动相容器内。

确认流动相的流速设定为 0.5 mL/min。该流速可使所有组分在 5 min 内洗脱，同时足够缓慢以确保各峰之间的分离度。

接下来，验证溶剂输送系统的最低和最高压力设置。这些设置分别用于在发生泄漏或堵塞时关闭泵。

按下检测器前面板上的“zero”按钮以设置空白。用去离子水冲洗一支100 µL的注射器，然后用数份1种7种工作标准溶液润洗，再用该溶液充满注射器。首先依次分析3种单组分样品，以确定每种组分的色谱峰。

接下来，将注射器手柄置于加载位置，手动注入溶液。通过隔垫端口缓慢注入 100 µL 溶液。

确认数据采集程序已设置为采集 300 s 的数据，以确保所有 3 个峰均有足够时间流经检测器。准备开始试验时，将进样器手柄旋转至“进样”位置，以将样品注入流动相中。随即在数据采集程序中点击“开始试验”。扫描完成后，对其余 7 种标准溶液重复上述过程。对于前 3 种标准溶液，每种仅出现 3 个峰中的 1 个。记录峰的位置，用于确定对应组分。

选取3个无糖饮料样品，置于敞口容器中静置过夜，以去除碳酸化气体。

经过一夜脱气后，用塑料注射器吸取每种无糖汽水约 3 mL。然后，在注射器上安装滤膜针头，将汽水通过滤膜推入玻璃小瓶中，以去除任何固体颗粒。

将每份样品2 mL与2 mL流动相混合，使碳酸饮料的浓度降低一半。

用注射器吸取100 µL其中一种汽水样品，注入样品环中。使用与标准溶液相同的参数运行检测。对每种汽水样品重复此操作。

首先，将标准样品的峰面积与已知浓度进行关联。为此，使用三角形法在色谱图上确定每个标准样品的峰面积。将峰高乘以峰高一半处的宽度，以此值作为峰面积进行计算。

利用峰面积和已知浓度为每种组分绘制校准曲线，并确定每条校准曲线的最小二乘拟合。

根据峰面积计算每种成分在饮食型苏打水中的浓度。请注意，苏打水在注入高效液相色谱仪（HPLC）前均已稀释了2倍。根据这些结果，计算每罐12盎司（oz）苏打水中各成分的毫克（mg）含量。

不出所料，所测试的3种碳酸饮料中苯甲酸盐防腐剂的含量大致相同。然而，可口可乐产品的咖啡因含量更高。所有组分的计算值与生产厂家公布的数值具有良好的相关性。

HPLC 是一种高度通用的仪器，广泛应用于多种分析中。

高效液相色谱法（HPLC）常用于纯化肽分子。在此示例中，制备了跨膜肽复合物，然后通过二硫键对蛋白质进行氧化交联以使其稳定。

然后将蛋白质溶解于甲酸中，并使用反相高效液相色谱法进行纯化。随后采用两种溶剂的线性梯度洗脱样品，并通过质谱法确认其纯度。

高效液相色谱法也可用于鉴定实验室中合成的有机化合物。在米勒-尤里实验中，研究了原始地球条件下有机化合物的非生物合成过程。将甲烷和氨等原始气体通入含有水的烧瓶中，以模拟早期海洋环境。随后施加电火花，模拟原始地球上的闪电现象。

随后采用高效液相色谱法联用质谱对水样进行分析，并与已知的氨基酸标准品进行比对。本实验共合成并鉴定了23种氨基酸。

您刚刚观看了 JoVE 关于高效液相色谱（HPLC）的介绍。现在您应该了解了如何操作该仪器以及分析所得数据的基本原理。

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