Summary
Gua Sha, de traditionele Chinese therapeutische huid schrapen, veroorzaakt onderhuidse microvasculaire bloed extravasatie. Wij rapporteren een protocol van bioluminescentie beeldvorming van HO-1-
Abstract
Gua Sha is een traditionele Chinese folk therapie die de huid heeft schrapen om onderhuidse microvasculaire bloed extravasatie en blauwe plekken veroorzaken. Het protocol voor bioluminescente optische beeldvorming van HO-1-
Protocol
- Vrouwelijke HO-1-luciferase transgene muizen (leeftijd van 4-6 weken) kunnen worden gekocht bij Taconic Farms, Inc Bij aankomst worden muizen geplaatst in een huisvesting van de dieren faciliteit voor ten minste 4 dagen naar de accommodatie mogelijk te maken.
- Voorbereiding voor bioluminescentie beeldvorming:
- Weeg iedere HO-1 muis. Dier gewicht is nodig voor het berekenen van de dosering van luciferine.
- Ontharen: Gebruik een katoenen swap om haar remover Nair ® toe te passen op de buik en / of rug van het dier. Wachten op 5 tot 10 seconden. Gebruik een schone katoenen swap te vegen haar. Dip een stukje weefsel in gedestilleerd water schoon te maken de resterende haren schoon te vegen.
- Plaats een niet-fluorescerende zwart papier (Strathmore Artagain ® zwart papier) op de beeldvorming platform van een IVIS 100 station om achtergrondgeluid te verminderen.
- Bereid luciferine (vanaf Xenogen Corporation) oplossing bij een concentratie van 7,5 mg / ml (opgelost in steriel H 2 O). De dosering van luciferine is 65,5 mg / kg lichaamsgewicht. Zo, een 20 gram muis vereist intraperitoneale injectie van 0,175 ml luciferine oplossing. Om dit te bereiken, is een enkele injectie volume van luciferine oplossing (0.175ml) voorgeladen met een injectiespuit met een 26-gauge naald
- Gua Sha procedure: Gua Sha is slechts een keer toegepast voor het uitvoeren van de bioluminescentie imaging protocol. Omdat Gua Sha is niet pijnlijk, de muis hoeft alleen maar even verdoofd worden door isofluraan kalm te blijven. Gua Sha procedure omvat de volgende stappen:
- Toe te passen olie of gedistilleerd water op de huid gebieden het doelwit van Gua Sha een paar keer tijdens de Gua Sha procedure te smeren.
- Herhaaldelijk schraap het haar-vrij gebied van de achterkant van de muis in zachte maar stevige kracht met behulp van een keramische soep lepel of een plastic lepel.
- Het schrapen gaat door totdat de achterkant huid wordt rood, wat een teken is van de onderhuidse bloed extravasatie, gewoonlijk bereikt binnen 2 tot 3 minuten.
- Bioluminescentie beeldvorming kan onmiddellijk of enkele uren worden gestart na Gua Sha als HO-1 opregulatie is opgebouwd langzaam over een paar uur. De procedure voor bioluminescentie beeldvorming:
- Verdoven van de muis in een anesthesie inductie kamer gevuld met een mengsel van isofluraan (1,5%) en medische kwaliteit lucht.
- Zodra de muis wordt verdoofd, beweeg de muis naar de beeldvorming kamer op de IVIS 100 optische beeldvorming station. Plaats de muis in een liggende positie (buik omhoog). De imaging kamer wordt continu doordrenkt met 1,5% van isofluraan. De imaging platform wordt verwarmd bij 37 ° C te houden de muis te warm.
- Stel de beeldvorming acquisitie op "medium binning" en de belichting tijd om 30 seconden. Start om beelden te verwerven. Stel de machine naar de beeldvorming worden herhaald om de drie minuten, handmatig of automatisch. Na de overname van het eerste beeld, is een regio van belang (ROI) gevestigd op de buik, borst en hoofd te bedekken. Dit ROI is dan gekopieerd en geplakt om de volgende beelden met behulp van "Living Image ®", software die bij de IVIS 100 station.
- Intensiteit van het signaal wordt gemeten in fotonen per seconde. Markeer tijd voor de intensiteit van het signaal om de piekwaarde te bereiken en te houden op de beeldvorming van de muis voor ongeveer 5 tot 10 minuten na de piek tijd.
- Wanneer de beeldvorming overname op de rugligging klaar is, draait u de muis over en leg hem in buikligging (back-up). Ga door beeldvorming het dier 5 tot 10 minuten met de ROI nu gevestigd op de rug en het hoofd gebied in het gebruik van de software "Living Image ®" te dekken. De keuze van de beeldvorming van de buikligging na de rugligging is arbitrair. Men kan ervoor kiezen om te beginnen met de buikligging, afhankelijk van de primaire organen van belang. Een andere optie is om het imago van de rug en naar voren gebogen posities bij verschillende experimenten.
- Wanneer de beeldvorming overname op de buikligging is voltooid, schakelt u isofluraan en beweeg de muis van de beeldvorming kamer naar de inductie kamer om te herstellen. De inductie kamer is nu doordrenkt met medische lucht alleen en de muis meestal wakker in minder dan een minuut.
- Sparen beeldgegevens voor post-processing.
- Na de eerste Imaging studie, zijn aanvullende beeldvormende overnames uitgevoerd gedurende enkele dagen na de Gua Sha. Een monster schema wordt herhaald beeldvorming op de 12 e uur, 24 ste uur, 36 e uur, 48 ste uur, 72 e en 120 e uur uur, maar de exacte timing van de imaging schema is flexibel. Bijkomende beeldvorming sessies kunnen worden toegevoegd indien een langere follow-up nodig is. Voor de beeldvorming, herhaal dan de haren te verwijderen procedure als het haar weer gegroeid.
- Voor de controle groep, alles herhalen, maar de procedure over te slaan Gua Sha (stap 3). Als dezelfde groep muizen wordt gebruikt voor zowel controle en Gua Sha, de controle experiment dient te worden uitgevoerd bij voorkeur vóór de Gua sha procedure of ten minste een maand erna.
Representatieve resultaten:
De bioluminescentie afbeeldingen in figuur 1 show in vivo opregulatie van HO-1 in reactie op Gua Sha. De grafiek in Figuur 2 toont de kwantitatieve tijdelijke verandering meer dan 120 uur in optische flux (fotonen / sec) van het hele lichaam van dezelfde muis met betrekking tot Gua Sha ...
Figuur 1. Van links naar rechts, representatief beeld van het vooraanzicht (rug) van dezelfde muis voor Gua Sha, om 18 uur, 36 uur en 120 uur na de Gua Sha, respectievelijk. Na Gua Sha, een observeert de voortgang van de aanzienlijke toename van de intensiteit van het signaal meerdere organen welke regio's van het maagdarmkanaal, de voortplantingsorganen, de lever, de nieren (aan de achterkant te bekijken, niet afgebeeld), en anderen omvatten. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 1.
Figuur 2. Kwantitatieve verandering van de flux (fotonen / sec) van het hele lichaam gevolgd meer dan 120 uur na Gua Sha in dezelfde muis van Figuur 1. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 2 te zien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transcriptie van HO-1, een induceerbare vorm van heem oxygenase, wordt opgereguleerd door vele factoren, waaronder heem, waterstof peroxide, UV-straling, hypoxie, en lichamelijke spanningen. Het gehele lichaam, zoals de gerapporteerde HO-1 bioluminescentie-protocol zorgt voor een snelle momentopname van systemische HO-1 expressie in meerdere organen. In kleine dieren, bioluminescentie imaging maakt het mogelijk hoge gevoeligheid in-vivo real-time kwantitatieve longitudinale optische beoordeling van veranderingen in de systemische genexpressie, zoals afgebeeld. Bioluminescentie moleculaire beeldvorming verlaagt de kosten en verhoogt de doorvoer van genexpressie testen in kleine dieren, waardoor het praktisch om snel bereiken van de statistische power die nodig is voor onderzoek naar complexe systemen biologie hypothese en om te beoordelen voor de systemische effecten van de voorgestelde farmaceutische en andere therapeutische interventies. Een beperking is een lage ruimtelijke resolutie van de anatomie. Nieuwere optische beeldvorming systemen die tomografische mogelijkheden zou hebben op het probleem te verhelpen. Beeldacquisitie en registratie door de micro-CT of MRI klein dier zou helpen om de juiste identificatie van de anatomie. Andere beperkingen zijn lage lichtinval door weefsel en de noodzaak van transgene dieren. Deze in wezen weg vertaling naar grotere dieren of menselijk gebruik, maar zijn niet een belangrijk nadeel voor kleine dieren systeembiologie of preklinische therapeutische hypothese testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
K. Wong, STC Wong worden ondersteund door de financiering van de Functionele en Molecular Imaging Center, Brigham and Women's Hospital
K. Wong, STC Wong worden ondersteund door het Centrum voor Biotechnologie en Informatica, The Methodist Hospital Research Institute, Weill Cornell Medical College.
KK Kwong, I. Chen, JQ Ren worden ondersteund door de financiering van de Athinoula A. Martinos Center for Biomedical Imaging, Massachusetts General Hospital.
Lenuta Kloetzer, Braden Kuo worden ondersteund door financiering uit het Neuroenteric Research Center, Massachusetts General Hospital
De auteurs danken Drs. Q. Zeng en X. Xu van Optical Imaging Lab, Brigham and Women's Hospital voor technische hulp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luciferin | Caliper Life Sciences | P/N 122796 | Previously Xenogen |
| IVIS 100 | Caliper Life Sciences | Previously Xenogen |
References
- Zhang, W. Selection of potential therapeutics based on in vivo spatiotemporal transcription patterns of heme oxygenase-1. J Mol Med. 80, 655-6564 (2002).
- Zhang, W. Rapid in vivo functional analysis of transgenes in mice using whole body imaging of luciferase expression. Transgenic Res. 10, 423-434 (2001).
- Contag, C. H., Stevenson, D. K. In vivo patterns of heme oxygenase-1 transcription. J Perinatol. 21, Suppl 1. 119-1124 (2001).
- Nielsen, A., Knoblauch, N. T., Dobos, G. J., Michalsen, A., Kaptchuk, T. J. The effect of Gua Sha treatment on the microcirculation of surface tissue: a pilot study in healthy subjects. Explore (NY). 3, 456-466 (2007).
- Schwickert, M. E., Saha, F. J., Braun, M., Dobos, G. J. Gua Sha for migraine in inpatient withdrawal therapy of headache due to medication overuse. Forsch Komplementmed. 14, 297-300 (2007).
- Tsai, P. S., Lee, P. H., Wang, M. Y. Demographics, training, and practice patterns of practitioners of folk medicine in Taiwan: a survey of the Taipei metropolitan area. J Altern Complement Med. 14, 1243-1248 (2008).
- Nielsen, A. Gua sha research and the language of integrative medicine. J Bodyw Mov Ther. 13, 63-72 (2009).
- Contag, C. H. Visualizing gene expression in living mammals using a bioluminescent reporter. Photochem Photobiol. 66, 523-531 (1997).
- Cui, K., Xu, X., Zhao, H., Wong, S. T. A quantitative study of factors affecting in vivo bioluminescence imaging. Luminescence. 23, 292-295 (2008).
- Shibahara, S., Yoshida, T., Kikuchi, G. Mechanism of increase of heme oxygenase activity induced by hemin in cultured pig alveolar macrophages. Arch Biochem Biophys. 197, 607-617 (1979).
- Lee, P. J. Hypoxia-inducible factor-1 mediates transcriptional activation of the heme oxygenase-1 gene in response to hypoxia. J Biol Chem. 272, 5375-5381 (1997).
- Maines, M. D. The heme oxygenase system: a regulator of second messenger gases. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 37, 517-554 (1997).
- Wunder, C., Potter, R. F. The heme oxygenase system: its role in liver inflammation. Curr Drug Targets Cardiovasc Haematol Disord. 3, 199-208 (2003).
- Hoekstra, K. A., Godin, D. V., Cheng, K. M. Protective role of heme oxygenase in the blood vessel wall during atherogenesis. Biochem Cell Biol. 82, 351-359 (2004).
- Yang, N. C., Lu, L. H., Kao, Y. H., Chau, L. Y. Heme oxygenase-1 attenuates interleukin-1beta-induced nitric oxide synthase expression in vascular smooth muscle cells. J Biomed Sci. 11, 799-809 (2004).
- Morse, D., Choi, A. M. Heme oxygenase-1: from bench to bedside. Am J Respir Crit Care Med. 172, 660-670 (2005).
- Ryter, S. W. Protective functions of heme oxygenase-1 and carbon monoxide in the respiratory system. Antioxid Redox Signal. 9, 2157-2173 (2007).
- Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. In vitro and in vivo bioluminescence reporter gene imaging of human embryonic stem cells. J Vis Exp. , (2008).
- Calabrese, V. Vitagenes, dietary antioxidants and neuroprotection in neurodegenerative diseases. Front Biosci. 14, 376-397 (2009).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H.
