Summary
תכונה אחת של מחלת אלצהיימר היא העלאת Aβ
Abstract
ירידת ערך של קשרים סינפטיים צפוי בבסיס השינויים בשכחה עדין המתרחשים בשלבים המוקדמים של מחלת אלצהיימר (AD). β עמילואיד (Aβ), פפטיד המיוצר בכמויות גבוהות לספירה, ידוע להפחית הגברה לטווח ארוך (LTP), הסלולר לתאם של למידה וזיכרון. אכן, פגיעה הנגרמת על ידי LTP Aβ היא פרדיגמה ניסויית שימושי לחקר תפקוד סינפטי במודלים לספירה עבור תרופות ההקרנה מסוגל מקלים או מביטול ליקויי הסינפטי כאלה. מחקרים הראו כי Aβ מייצרת את שיבוש LTP מועדף באמצעות טופס oligomeric שלה. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור LTP פגיעה על ידי טפטוף של oligomerized סינתטי Aβ1-42 פפטיד על פרוסות בהיפוקמפוס חריפה. בסרטון זה, אנו המתאר הליך צעד אחר צעד להכנת Aβ oligomeric
Protocol
Resuspending β עמילואיד פפטיד
לפני תחילת העבודה יש להכין:
- Aβ 1-42 (אבקת lyophilized)
- 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-Propanol (HFIP)
- נמוך מחייב microcentrifuge צינורות פוליפרופילן (1.5 מ"ל)
- GasTight המילטון מזרק עם להפסיק לצלול טפלון (250 μl)
- Dimethylsulfoxide (DMSO)
- אפשר Aβ lyophilized 1-42 לאזן בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, כדי למנוע התעבות עם פתיחת הבקבוקון פפטיד.
- מתחת למכסה המנוע קטר, מחדש להשעות Aβ 1-42 פפטיד HFIP קרים כדי להשיג פתרון 1 מ"מ המערבולת פתרון לכמה שניות.
- באמצעות מזרק זכוכית GasTight המילטון עם תוסף טפלון, במהירות לחלק את הפתרון Aβ 1-42 / HFIP שווה לשלוש מבחנות פוליפרופילן לאטום את צלוחיות.
- צלוחיות מודגרת אז עבור 2 שעות על מנת לאפשר monomerization Aβ. לאחר מכן, לפתוח את צלוחיות להתרכז הפתרון 1-42 / HFIP Aβ תחת ואקום באמצעות צנטריפוגות SpeedVac (800 גרם, בטמפרטורת החדר) עד סרט פפטיד ברור הוא ציין בתחתית צלוחיות. בדוק היטב את הטמפרטורה בתוך בצנטריפוגה SpeedVac כדי למנוע השפלה פפטיד (מקסימום 25 ° C).
- החותם צלוחיות בחנות aliquots ב -80 ° C. הסרט Aβ יכול להיות מאוחסן במשך 6 חודשים.
- Re-להשעות סרט אחד על ידי הוספת DMSO לקבל ריכוז של עד 5 מ"מ Aβ 1-42. Sonicate באמבט מים במשך 10 דקות על מנת להבטיח להשלים מחדש ההשעיה.
- זה Aβ 5mm Aliquot 1-42 פתרון לתוך צלוחיות פוליפרופילן. חותם את כל בקבוקוני ולאחסן אותם ב -20 ° C. Aliquots צריך להיות מופשר רק פעם אחת. היזהרו עיבוי מים בתוך המקפיא. פפטידים בתמיסה לבזות בקלות רבה.
Oligomerization
לפני תחילת העבודה יש להכין:
- Aβ 1-42 / DMSO (5mm)
- פוספט סטרילי חיץ
- נמוך מחייב microcentrifuge צינורות פוליפרופילן (1.5 מ"ל)
- נמוך מחייב צנטריפוגות צינורות פוליפרופילן (50 מ"ל)
- לדלל את Aβ 5mm לקבל 1-42 / aliquot DMSO עם חיץ סטרילי פוספט (עד 100 μl).
- וורטקס למשך 30 שניות ואז דגירה של 12 שעות 4 ° C
פרוסה בהיפוקמפוס טיפול
כאשר מטפלים פרוסות בהיפוקמפוס, חשוב להימנע הלא ספציפית פפטיד הדבקה על כוסות, משטחים צינורות טפטוף, ואת חדר ההקלטה. השתמש מעדיפים נמוך מחייב צינורות פוליפרופילן מכולות. יש להימנע משימוש של כלי זכוכית או פלסטיק, כלי גנרי. התקשורת צריכה להיות זלוף בסרום או אלבומין חינם.
Aβ זלוף
לפני תחילת העבודה יש להכין:
- Oligomerized Aβ 1-42
- חיץ הקלטה (במ"מ: 124 NaCl, KCl 4.4, 1 Na 2 HPO 4, 25 NaHCO 3, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 גלוקוז)
- הקלטה אלקטרו הגדרת ממשק עם תא
- פרוסות בהיפוקמפוס רוחבי מודגרות במאגר הקלטה מחומצן במשך לפחות 90 דקות לאחר דיסקציה (ט = 29 ° C; זלוף שיעור קבוע = 2 מ"ל / דקה)
- מיד לפני הניסוי, לדלל את aliquot 1-42 oligomerized Aβ לריכוז עבודה מתאימה (200 ננומטר ומעלה) בתוך צינור פוליפרופילן עם חיץ מראש מחומצן ההקלטה.
- Perfuse הפתרון Aβ 1-42 במשך 20 דקות את פרוסות לפני הגיוס של הפלסטיות הסינפטית.
אינדוקציה של הפלסטיות ומעקב
- בדרך כלל, המודל הנפוץ ביותר בשימוש של הפלסטיות הסינפטית הוא LTP. זה יכול להיגרם על ידי גירוי של סינפסה tetanic נתון בהיפוקמפוס. אנו רושמים תגובות השדה סינפסות בין התחזיות בטחונות של שפר ו CA1 עצב פירמידליים ב radiatum בשכבה. גירוי tetanic שלנו מורכב גירוי פרץ תטא הכולל 3 רכבות מופרדות 15 מרווחי השני. כל רכבת מורכב על 10 התפרצויות הרץ 5 שבו פרץ כל המשתמע מכך 5 פעימות ב 100 הרץ. החל את הגירוי tetanic מיד לאחר זלוף של Aβ oligomerized הושלמה.
- מיד לאחר גירוי tetanic לחזור זלוף עם חיץ הקלטה רגילה. שמרו על קצב טפטוף קבוע, טמפרטורת חדר הקלטה חמצון תקין לאורך כל תקופת הניסוי.
תוצאות ייצוגית בעיות אפשריות
Aβ oligomerized לפי הפרוטוקול הקלאסי של Stine et קול. 1, מייצר מונומרים Aβ ועוד מגוון של oligomers גודל שונהs (דימר, trimer, וכו ') זלוף של oligomerized Aβ 1-42 מוביל LTP ירד Aβ שטופלו פרוסות פרוסות לעומת שליטה. תחת תנאי הניסוי שלנו, איפה ישנים 3-5 חודש C57BL/6J עכברים זכרים רגילים, LTP ב 200 ננומטר Aβ שטופלו פרוסות על 150% הממוצע של ערכי הבסיס על שעתיים לאחר גירוי tetanic, בעוד פרוסות לשלוט ערכים הם LTP על ממוצע של 200-250% baseline2. במקרים מסוימים, הטיפול עלול להיכשל Aβ להפחית LTP בהיפוקמפוס. כמה טעויות קריטיות שעלולות להתרחש כוללים הסרט מופרז במהלך הייבוש ריכוז Aβ ו oligomerization שלם. זלוף Aβ בפרוסות ההיפוקמפוס עשוי להיות עוד מקור לדאגה בגלל המאפיינים physicochemical של הפפטיד Aβ פתרון, אשר נוטה הידבקות הלא ספציפית כדי פלסטיק. פתרון של בעיות אלה נדון להלן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כפי שתואר לעיל, מספר בעיות בהכנת Aβ oligomeric עלול לגרום LTP נפגמה. אחת הדרכים להעריך אם Aβ השפלה או חוסר oligomerization Aβ ייתכן שאירעו היא להעריך את הכנת Aβ באמצעות טריס-PAGE Tricine / ניתוח סופג המערבי ultracentrifugation אנליטית (לא תיארו בפרוטוקול זה). כאשר דגימות סופג המערבי מוכנים בתנאים non-denaturing/non-reducing, הכנה מוצלחת יש ליצור חתימה סופג המערבי בהשתתפות להקות המתאים מונומרים ו oligomers שונה 3. סוגיה המתרחשים לעתים קרובות הוא חוסר יציבות פפטיד במהלך השלב ייבוש concentrator SpeedVac. למעשה, בטמפרטורה גבוהה ייבוש מוביל פירוק חלבונים, מורגש על ידי צבע פפטיד בולט חום. ריכוז של הפתרון HFIP צריך להתבצע בטמפרטורת החדר במעקב צמוד. בהתחשב במספר צעדים פרוצדורליים המתרחשים הפרוטוקול, שגיאות דילול עלול בטעות להוביל oligomerization עניים או ריכוז Aβ מטעה. מעניין, זלוף עם ריכוזים Aβ נמוך יותר מאשר הציע תביא ערכים LTP גדל 3. שוב, זלוף משפיע על תוצאה אפשרית של הטיפול Aβ על פרוסות. אכן, שמירה על טמפרטורה קבועה של הפתרון אמבטיה בניסויים אלקטרו שלנו היא קריטית כמו טמפרטורה ידוע להשפיע על תצורות Aβ כאשר פתר במאגר פוספט. מקור נוסף דאגה היא Aβ oligomeric עשוי הלא במיוחד להיצמד משטחי הפלסטיק של מכולות בצינור המשמש הכנה זלוף ובכך להפחית את ריכוז יעיל חשוף פרוסות בהיפוקמפוס. לכן, חשוב להשתמש נמוכה חלבון מחייב פלסטיק כלי כדי להבטיח היערכות אמין perfusions ברחבי ניסויים שונים. בגיליון זה, אנו מציעים כלי פלסטיק פוליפרופילן אשר הוכח שלא משפיעים על היחס של מינים שונים Aβ 4. ספרות ענפה עולה כי מחלת אלצהיימר נובעת כהפרעה הסינפטי 5. סביר להניח כי תחכום ושונות מן התסמינים המוקדמים בשכחה, המתרחשים בהיעדר סימנים קליניים אחרים של פגיעה מוחית, הן בשל שינויים בדידים בפונקציה של סינפסה אחת, מיוצר לפחות בחלקו, על ידי מינים Aβ ( למשל Aβ 42 ו Aβ 40) 2,6,7,8. הגילוי כי תכשיר המכיל Aβ oligomerized סינתטי 1-42 יכול לפגוע LTP 9 במבחנה הוביל החקירות הרבות לתוך מנגנוני תפקוד סינפטי המושרה על ידי העלאת Aβ במוח. שימוש בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הליך הכנת Aβ oligomeric אשר פוגעת בהצלחה LTP על הקשר בטחונות-שכבה radiatum שפר בפרוסות ההיפוקמפוס. זו פרדיגמה ניסויית יש ערך עצום על חקירת מנגנוני הפתוגנזה Aβ בתיווך וכן בדיקת תרופות פוטנציאליות, אשר עשויים להקל על תפקוד סינפטי 2,10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי אוניברסיטת קולומביה IACUC.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NIH המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ (NINDS) (NS049442).>
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aβ 1-42 (lyophilized) | American Peptide | 62-0-80 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-Propanol (HFIP) | Fluka | 52517 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Biotium, Inc. | 90082 | |
| 50mL Polypropylene Centrifuge Tubes | Corning | 05-538-67 | |
| 1.5ml MaxyClear microtubes Maximum recovery | Axygen Scientific | MCT-150-L-C | |
| Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | |
| GASTIGHT Syringes 250 μL | Hamilton Co | 1725 | |
| Bath sonicator | Branson | 3510 | |
| Savant SpeedVac Concentrator System | Various | SC 110A |
References
- Stine, W. B. Jr, Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278, 11612-11622 (2003).
- Vitolo, O. V. Amyloid beta -peptide inhibition of the PKA/CREB pathway and long-term potentiation: reversibility by drugs that enhance cAMP signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 13217-13221 (2002).
- Puzzo, D. Picomolar amyloid-beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus. J Neurosci. 28, 14537-14545 (2008).
- Lewczuk, P. Effect of sample collection tubes on cerebrospinal fluid concentrations of tau proteins and amyloid beta peptides. Clin Chem. 52, 332-334 (2006).
- Masliah, E. Mechanisms of synaptic dysfunction in Alzheimer's disease. Histol Histopathol. 10, 509-519 (1995).
- Cullen, W. K., Suh, Y. H., Anwyl, R., Rowan, M. J. Block of LTP in rat hippocampus in vivo by beta-amyloid precursor protein fragments. Neuroreport. 8, 3213-3217 (1997).
- Itoh, A. Impairments of long-term potentiation in hippocampal slices of beta-amyloid-infused rats. Eur J Pharmacol. 382, 167-175 (1999).
- Walsh, D. M. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature. 416, 535-539 (2002).
- Lambert, M. P. nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6448-6453 (1998).
- Gong, B. Ubiquitin hydrolase Uch-L1 rescues beta-amyloid-induced decreases in synaptic function and contextual memory. Cell. 126, 775-788 (2006).
- Trinchese, F. Inhibition of calpains improves memory and synaptic transmission in a mouse model of Alzheimer disease. J Clin Invest. 118, 2796-2807 (2008).
