Двухфотонная лазерная индуцированная нейронная травма: метод наблюдения аксоновой дегенерации и регенерации в личинках дрозофилы

Overview

Это видео описывает двухколоновую лазерную абляцию аксонов в личинке drosophila melanogaster и пример протокола, чтобы вызвать травму и изображение места травмы.

Protocol

Этот протокол является выдержкой из Li et al., Drosophila In Vivo Injury Model для изучения нейрорегенерации в периферической и центральной нервной системе, J. Vis. Exp. (2018).

1. Двухфотенная травма и конфокальные изображения

1. Установка микроскопа
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого эксперимента был использован конфокальный лазерный сканирующий микроскоп с двухфотен-лазером, но и других систем с эквивалентной установкой также будет достаточно. Двухфотонный лазер (930 нм) был использован для доставки травмы и аргон лазер (488 нм) был использован для конфокальных изображений GFP.
   1. В начале каждого сеанса включите двухфотенный лазер и/или конфокальный лазер (ы) и микроскоп. Откройте программное обеспечение для визуализации.
   2. Для получения двух фотонной травмы установите следующие параметры для визуализации GFP с двух фотон-лазером на 930 нм (1 950 мВт).
      1. Выберите режим сканирования строки. Открой пинхол всю дорогу. Увеличьте интенсивность лазера до 20% (390 мВт).
      2. Выберите 512 x 512 в качестве сканирования кадра. Используйте максимальную скорость сканирования (обычно с пиксельным временем обитания на уровне 0,77 с). Убедитесь, что среднее число 1 и глубина бита составляет 8 битов.
      3. Установите выигрыш до 750 фунтов стерлингов, а смещение до 0.
      4. Сохранить этот заранее установленный экспериментальный протокол, как 2P GFP 930 Абляция, что позволяет легко повторно использовать в будущих экспериментах.
   3. Для конфокальных изображений найте следующие параметры для визуализации GFP с помощью лазера Argon на 488 нм:
      1. Выберите вкладку Приобретение, а затем - стек.
      2. Под"Лазером",включите мощность для 488 нм Аргон лазера.
      3. Перейти к каналам,выбрать 488 мм лазера, и увеличить мощность лазера до 5-10%. Для пинхол, используйте 1-2 воздушный блок (AU). Отрегулируйте выигрыш до 650.
      4. В режиме приобретения,выберите 1024 x 1024 в качестве сканирования кадра, используйте максимальную скорость сканирования, среднее число 2, и бит глубиной 8 бит.
      5. Сохраните этот заранее установленный экспериментальный протокол в качестве GFP Imaging.
2. Личинок анестезии с дитил эфира и монтажа
   1. В дымовой капот поместите 60-мм стеклянную тарелку в 15-сантиметровую пластиковую чашку Петри. Сложите и положите лист бумаги на дно стеклянной тарелки, затем поместите агарную тарелку виноградного сока на ткань. Добавить дитетил эфир в стеклянную тарелку, до точки, где ткань пропитана и есть слой жидкого эфира, оставшихся в блюде. Держите крышку на все времена.
   2. Подготовьте стеклянную горку с одной каплей галоуглеродного масла 27 в центре. Добавьте 4 пятна вакуумной смазки на четыре угла слайда, чтобы позже поддержать крышку.
   3. Используйте типсы, чтобы забрать очищенную личинку и поместить ее на агарную тарелку в 60-мм стеклянной тарелке. Обложка стеклянное блюдо с его крышкой и ждать, пока личинка перестает двигаться. Для PNS травмы / изображения, вынюхивать личинку, как только его хвост перестает дергаться. Для ЦНС подождите, пока вся личинка станет неподвижной, особенно головные сегменты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сроки воздействия эфира имеет решающее значение. Смотрите Обсуждение.
   4. Аккуратно возьмите обезболивающее личинку и поместите ее головой в вертикальном положении в каплю галоуглеродного масла на слайде. Добавьте крышку поверх слайда. Используйте нежное давление, чтобы нажать вниз на крышку, пока она не коснется личинки (Рисунок 1A).
   5. Отрегулируйте положение личинки, осторожно толкая крышку влево или вправо, чтобы свернуть личинку, так что нейрон / аксон / дендрит интерес находится на верхней и ближе всего к объективу микроскопа.
   6. Для травмы PNS, смонтировать личинки спинной стороны вверх, так что оба трахеи видны. Затем рулон личинки 30 градусов влево для травмирования класса III да нейронов аксонов (Рисунок 1B и 1C), 90 градусов за травму класса IV да нейрон аксонов (Рисунок 1B и 1E), или 30 градусов за травму класса IV да нейрон дендритов (Рисунок 2A).
   7. Для травмы ЦНС, положение личинки, чтобы быть совершенно брюшной стороне вверх(рисунок 3A), так что область интереса ближе всего к микроскопу объектива в z-плоскости.
3. Травма от двух фотон лазера
   1. Поместите слайд с личинкой под микроскопом и закрекрете его на месте с держателем слайда на сцене. Используйте цель 10X (0.3 NA), чтобы найти личинку.
   2. Добавьте 1 каплю объективного масла на крышку, переключитесь на цель 40X (1.3 NA) и отрегулируйте фокус.
   3. Переключитесь в режим сканирования и повторно имитаторский протокол 2P GFP 930 Ablation. Убедитесь, что пинхол открыт всю дорогу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конфигурация должна быть оптимизирована на основе отдельных систем.
   4. Запустите режим Live, чтобы найти область интереса (ROI), и настроить настройки для достижения хорошего качества изображения с соответствующим зумом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цель этого шага состоит в том, чтобы найти нейрон / аксон / дендрит ранить, а не принимать лучшее качество изображения. Поэтому используйте минимальные настройки, достаточные для визуализации целевой области, чтобы избежать передержки или фотоотдачи.
   5. Остановите сканирование Live, чтобы кнопка Crop стала доступной. Пусть еще изображение служит в качестве дорожной карты. Выберите функцию Crop и отрегулируйте окно сканирования, чтобы сосредоточиться на цели, которая будет повреждена.
   6. Уменьшите рентабельность инвестиций, чтобы быть размером с предполагаемое место травмы. Например, просто покройте ширину аксона или дендрита, чтобы обеспечить точность травмы и уменьшить повреждение соседних тканей. При желании увеличьте рентабельность инвестиций перед обрезкой, что позволит более точно травмировать.
   7. Откройте новое окно изображений. Уменьшите скорость сканирования и увеличьте интенсивность лазера. Определите увеличение интенсивности лазера на основе сигнала флуоресценции тканей, сканируемого в режиме Live.
   8. Как правило, установить двух-фотон лазерной интенсивности, начиная с 25% для травмы PNS и 50-100% для травмы VNC. При повреждении аксонов PNS убедитесь, что интенсивность лазера составляет 480 мВт, а время обитаемого пикселя — 8,19. Для травмы аксона VNC, убедитесь, что интенсивность лазера и время обитаемого пикселя, как правило, 965-1930 мВт и 8,19-32,77 евро, соответственно.
   9. Начните непрерывное сканирование. Оставьте курсор парящим над кнопкой Непрерывный. Внимательно следите за изображением и прекратите сканирование, как только наблюдается резкое увеличение флуоресценции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Появление всплеска флуоресценции связано с автофлуоресценцией на месте травмы.
   10. Переключитесь обратно в режим Live, повторно излив настройки. Найдите регион, представляющий интерес, который был просто направлен на корректировку фокуса.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошим свидетельством успешной травмы является появление небольшого кратера, кольцевой конструкции или локализованного мусора прямо на месте повреждения.
   11. Переместись к следующему нейрону и повторите шаг 1.3.5, чтобы повредить несколько нейронов в одном животном. Или повторите шаг 1.3.5, постепенно увеличивая мощность и/или снижая скорость сканирования, если начальная травма была недостаточной.
       ПРИМЕЧАНИЕ: В случае, если мощность лазера слишком высока, большая поврежденная область будет видна на изображении после травмы в прямом эфире. Слишком много травм может привести к смерти личинки.
   12. Восстановить личинку, тщательно удалив крышку и передачи раненых личинки на новую тарелку с дрожжевой пастой. Канава несколько пещер на агар пластины с типсами; в качестве альтернативы, сделать остров агара в тарелке вместо того, чтобы использовать всю тарелку, чтобы уменьшить возможность личинки выползания из пластины.
   13. Положите тарелку в 60-мм чашку Петри с влажной тканью (пропитанной 0,5% пропионовой кислоты) и культуры при комнатной температуре или 25 градусов по Цельсию.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Личинка останется в личиночковой стадии в течение примерно дополнительного дня при комнатной температуре (22 градусов по Цельсию) по сравнению с 25 градусами По Цельсию.
4. Пост-травма конфокальные изображения
   1. Изображение пострадавшей личинки в нужные моменты времени путем подготовки личинки с использованием той же процедуры анестезии и монтажа, как в шаге 1.2, а затем изображения с конфокального лазера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изображение личинки на 24 ч после травмы (ИИ), чтобы подтвердить аксональные травмы и на 48 ч ИИ (класс IV да нейронов) или 72 ч ИИ (класс III да нейронов) для оценки регенерации.
   2. Найдите личинку с помощью цели 10X, а затем переключитесь на цель 25X (0.8 NA). Повторное использование экспериментального протокола GFP Imaging.
   3. Нажмите кнопку Live и найти тот же нейрон ранен ранее.
   4. Установите первую и последнюю позиции в окне сканирования в реальном эфире. Нажмите стоп и нажмите Кнопку Начать эксперимент, чтобы получить изображение в стеке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что точка нормализации (точка сближения аксона) включена при захвате изображений, чтобы можно было количественно оценитьрегенерацию (рисунок 1D, 1F)- это обсуждается далее в разделе анализа данных.
   5. Переключитесь на обработкуизображений, выберите только что взятое изображение и создай проекцию максимальной интенсивности. Сохранить как z-стек и максимальной интенсивности проекционных изображений.

Representative Results

Рисунок 1: Регенерация аксонов da нейронов на периферии отображает классовую специфику. (Aи B) Схематический рисунок, показывающий положение личинок. (C)Схематический рисунок класса III да нейронов. (D) Аксоны класса III да нейронов ddaF, помечены 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, репо-Gal80 / , не в состоянии вырастить. (E)Схематический рисунок класса IV да нейронов. (F) Аксоны класса IV да нейронов v'ada, помечены ppk-CD4-tdGFP / , вырасти за пределами места поражения. (Dи F) Красная линия указывает длину аксона, в то время как зеленая пунктирной линии отмечает расстояние между телом клетки и точкой сближения аксона (DCAC). Синяя точка обозначает точку сближения аксона. Масштабная планка 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Da нейрон дендрита регенерации. (A)Иллюстративное представление iv класса да нейронов. (B) Иллюстративное представление регенерации дендрита в классе IV да нейрон ddaC, помеченный ppk-CD4-tdGFP/ Лазерная абляция направлена на первичную точку ветви и проводится на уровне 48 ч AEL. При 24 ч ИИ подтверждена трансекция нейрита, а при 72 ч квантифицируется регенерация ИИ. Дендриты нейронов ddaC демонстрируют значительное отрастание, с новыми дендритными ветвями, прорастающих от отрезанного стебля до плитки вакантного пространства. Стоит отметить, что новые ветки терминала постоянно добавляются к невредимым дендритам на данном этапе развития. Масштабная планка 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Da регенерации аксона нейрона в VNC. (A)Схематический рисунок личинки дрозофилы, установленной на слайде и изображенной под микроскопом. Аксоны iv-класса да нейронов в VNC визуализированы в личинке ppk-CD4tdGFP/ Два сегмента комиссариата кандидатов отображаются на увеличенное изображение и схематический рисунок. Каждый из них имеет два места травмы (красные круги). (B)Конфокальные изображения одного травмированного сегмента, изображенного на 8, 24 и 72 ч после травмы (ИИ). Красные линии изображают переросые аксоны. (C)Измерение и нормализация переростых аксонов. Масштабная планка 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous	Acros Organics	AC615080010
Halocarbon 27 Oil	Genesee Scientific	59-133
Propionic Acid	J.T.Baker	U33007
Cover Glasses: Rectangles	Fisher Scientific	12-544-D	50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 laser scanning microscope	Zeiss
Zen software	Zeiss
Chameleon Ultra II	Coherent