Unidades de Formação de Colônias de Contagem (CFUs): Quantificação de Bactérias de Corpos voadores

Overview

A microbiota de drosophila impacta o desenvolvimento, imunidade e fisiologia do animal. Este vídeo descreve um método para quantificar bactérias de moscas, determinando a colônia formando unidades a partir de preparações corporais inteiras. O protocolo em destaque demonstra a técnica com moscas, criadas sob condições gnóbiticas usando quatro espécies bacterianas.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Koyle et al., Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobitic Conditions, J. Vis. Exp. (2016).

1. Ovos descolados e transferência para dieta estéril

1. Prepare o armário de biossegurança pulverizando o interior (incluindo os lados) com 70% de etanol. Limpe o fundo com um tecido de laboratório e esterilize o capô com luz UV por ~15 min. Esterilize todos os suprimentos não biológicos (copos de espécime, pincel, fórceps, recipiente de resíduos, 400 ml de água esterilizada e 100 ml de hipoclorito de sódio de 0,6%) pulverizando com etanol e imediatamente colocando no armário de biossegurança. Esterilize com luz UV por 15 minutos.
2. Inicie a primeira de 2 lavagens de hipoclorito de sódio colocando a bucha com os ovos em um copo de espécime de 120 ml ou outro recipiente estéril. Despeje lentamente ~90 ml de solução de hipoclorito de sódio de 0,6% na bucha até logo abaixo da borda.
3. Enxágüe ovos por 2,5 min. Suspender periodicamente os ovos usando fórceps para mover a bucha para cima e para baixo na solução de hipoclorito.
4. Transfira a bucha diretamente para um segundo copo de espécime, pré-preenchido com alvejante de 90 ml, dentro do armário de biossegurança.
5. Repita o passo 1.3 dentro do armário de biossegurança. No final do segundo tratamento alvejante, os ovos devem começar a aderir aos lados da bucha.
6. Realizar etapas 1.7-1.8 no gabinete de biossegurança.
7. Descarte o alvejante e lave a bucha com água estéril 3 vezes. Suspenda os ovos várias vezes durante cada lavagem movendo a bucha com fórceps. Até o final da terceira lavagem, a maioria dos ovos deve ser anexada ao lado da bucha.
8. Usando um pincel esterilizado em etanol, transfira ovos do lado da bucha para a dieta estéril. Transfira ovos individualmente ou em pequenos lotes. Aponte para 30-50 ovos por frasco. Deixe as tampas soltas para permitir que o oxigênio entre no tubo. Se os frascos permanecerem axenic, transfira para uma incubadora de insetos; caso contrário, adicione bactérias como abaixo.

2. Faça moscas gnóbiticas usando 4 espécies bacterianas

1. Preparar bactérias
   1. Prepare um armário de biossegurança esterilizado com suprimentos necessários (pipetas, caixas de ponta de pipeta, tubos de centrífuga esterilizados, caldo MRS e racks de tubo de ensaio) como na etapa 1.1. Limpe o lado de fora dos tubos de ensaio com um lenço de laboratório encharcado de etanol antes de colocar no armário de biossegurança.
   2. Pelotar as bactérias primeiro transferindo 500 μl de crescimento noturno para um tubo microfuge estéril. Se a densidade bacteriana for baixa, adicione até 1,5 ml a cada tubo ou remova sequencialmente sobrenante e adicione cultura extra ao mesmo tubo. Remova amostras do armário de biossegurança e centrífuga por 10 minutos a 10.000 x g. Use pontas de filtro para evitar contaminação entre amostras.
   3. Determine a densidade de cada cultura medindo OD₆₀₀. Se usar um leitor de placas multi-bem, transfira 200 μl de cada cultura para uma placa de 96 poços em diluições de 1, 2 e 4 vezes.
   4. Determine a quantidade de mMRS em que diluir cada pelota celular (2.1.2) usando um especttômetro de leitura de placa e as seguintes equações. Planeje adicionar caldo suficiente para inocular 50 μl a cada frasco de mosca.
      1. Colete leituras OD₆₀₀ para uma diluição de 1:1, 1:2 e 1:4 de cada cultura bacteriana em um espectótmetro de leitura de placas. Selecione a diluição para cada cepa bacteriana que produz um valor OD₆₀₀ entre 0,1 e 0,2 e use este valor e seu fator de diluição correspondente como 'O' e 'D' nas fórmulas dadas em 2.1.4.2 ou 2.1.4.3.
      2. Se usar as 4 espécies descritas aqui, normalize as células para densidades equivalentes da unidade formadora de colônias (CFU)/ml (conversão OD₆₀₀ para CFU determinada anteriormente em Newell e Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)) usando esta equação:
         E = ((O-B) x V x D)/C
         onde E = volume para resuspend pelotas em (μl), O = OD₆₀₀ bactérias, B = OD₆₀₀ mídia em branco, D = diluição do fold, V = cultura bacteriana μl antes da centrifugação, C = OD₆₀₀ de constante predeterminada. Consulte Arquivo de Código Suplementar para exemplos de cálculos usando essas equações. Para espectrômetros que em branco automaticamente, use "O" no lugar de "O-B".
         NOTA: As constantes predeterminadas (unidades OD₆₀₀, normalizadas para 10⁷ CFU ml^-1, constantes derivadas em Newell e Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)) são as seguintes: A. tropicalis (0,052), A. pomorum (0,038), L. brevis (0,056), L. plantarum (0,077).
      3. Se estiver usando outras espécies bacterianas (não há constante de CFU/OD_600), normalize a densidade para OD₆₀₀ = 0,1 usando esta equação:
         E = ((O-B) x V x D)/0,1 OD₆₀₀
         NOTA: As unidades são as mesmas da etapa 2.1.4.2. Consulte Arquivo de Código Suplementar para exemplos de cálculos usando essas equações.
   5. No gabinete de biossegurança, remova o supernasce com uma ponta de pipeta e resuspenque a pelota em mMRS fresco ou PBS conforme calculado na etapa 2.1.4.2.
2. Bactérias Inoculadas
   1. Transfira 50 μl da bactéria para os tubos cônicos com dieta estéril e ovos descorioados em armário de biossegurança. Adicione bactérias após a transferência de óvulos para evitar contaminação entre frascos.
   2. Coloque tubos inoculados em uma incubadora a 25 °C.

3. Medir a carga/teste da CFU para a esterilidade

1. Para medir a carga da UFC em toda a carga corporal homogeneiza, transfira 5 moscas (5-7 dias após a eclosão) para um tubo de microfuça de 1,7 ml contendo 125 μl de contas cerâmicas e 125 μl de caldo mMRS. Homogeneize moscas usando um homogeneizador de tecido por 30 segundos a 4,0 M/seg.
   1. Alternativamente, omitir contas e homogeneizar a mão em tubos de microcentrifuuge com pilões plásticos por 1 min.
   2. Se quantificar a microbiota intestinal, a superfície esteriliza as moscas para remover micróbios exógenos. Transfira moscas para um tubo de microcentrifuge contendo 100 μl 70% de etanol por 1 min, etanol aspirado e transferência para um novo tubo de microcentrifuge para homogeneizações. Se o conteúdo de DNA do intestino for medido, enxágue por 1 min com hipoclorito de sódio de 0,6% antes da lavagem do etanol.
2. Diluir o homogeneizar com 875 μl mMRS, vórtice por 5 segundos, e pipet 120 μl de homogeneizar no primeiro poço de uma placa de microtiter.
3. Realize duas diluições sequenciais 1:8 utilizando 10 μl homogeneizar e 70 μl mrs nos próximos dois poços.
   1. Retire 10 μl do primeiro poço e adicione-o ao segundo poço contendo 70 μl MRS. Misture o conteúdo do segundo bem bem bem, transfira 10 μl do segundo poço para o terceiro poço contendo 70 μl mrs, e misture bem. Isso leva a 3 concentrações totais dos 1.000 μl homogeneados originais: não diluídos, 1:8 e 1:64.
4. Transfira 10 μl de cada diluição para uma placa mMRS (usando uma tubulação multicanal, se desejar). Incline-se ligeiramente o prato para espalhar a diluição vários milímetros abaixo da superfície do ágar e permitir que o líquido seque antes de mover a placa. O líquido seca rapidamente na placa se as placas têm 2 dias de idade, reduzindo a mistura de duas gotículas vizinhas.
5. Incubar a 30 °C por 1-2 dias. Remova as placas da incubadora uma vez distintas, colônias individuais são visíveis, e contam a partir de uma diluição com 10-100 colônias isoladas.
6. Calcular CFU por mosca usando a equação E = C x D/P x V/F, onde E = CFU por mosca, C = número de colônias contadas, D = diluição, P = μl banhado, V = volume de mosca homogeneizada, e F = número de moscas homogeneizadas.

Representative Results

Arquivo de código suplementar: Cálculos amostrais. Clique aqui para ver este arquivo (clique com o botão direito do mouse para baixar).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brewer's Yeast	MP Biomedicals, LLC.	903312
Glucose	Sigma Aldrich	158968-3KG
Agar	Fisher--Lab Scientific	fly802010
Welch's 100% Grape Juice Concentrate	Walmart or other grocery store	9116196
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container	Webstaurant Store	999L5032Y
Translucent Round Deli Container Lid	Webstaurant Store	999YNL500
Stock Bottles	Genesee Scientific	32-130
Droso-Plugs	Genesee Scientific	49-101
Nylon Mesh	Genesee Scientific	57-102
Plastic Bushing	Home Depot	100404002
Plastic Bushing Cap	Home Depot	100153897
Specimen Cup	MedSupply Partners	K01-207067
Repeater M4	Eppendorf	4982000322
50 ml Centrifuge Tubes	TrueLine Centrifuge Tubes	TR2003
Food Boxes	USA Scientific	2316-5001
Lysing Matrix D Bulk	MP Biomedicals, LLC.	116540434
Filter Pipette Tips, 300 µl	USA Scientific	1120-9810
Petri Dishes	Laboratory Product Sales	M089303
Ethanol	Decon Laboratories, INC.	2701
Paintbrush	Walmart	5133
Forceps	Fisher	08-882
Household Bleach (6-8% Hypochlorite)	Walmart	550646751
Universal Peptone	Genesee Scientific	20-260
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-500
Dipotassium Phosphate	Sigma Aldrich	P3786-1KG
Ammonium Citrate	Sigma Aldrich	25102-500g
Sodium Acetate	VWR	97061-994
Magnesium Sulfate	Fisher Scientific	M63-500
Manganese Sulfate	Sigma Aldrich	10034-96-5
MRS Powder	Sigma Aldrich	69966-500G
96 Well Plate Reader	BioTek (Epoch)	NA
1.7 ml Centrifuge Tubes	USA Scientific	1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 µl	USA Scientific	1122-1830
96 Well Plates	Greiner Bio-One	655101
Ceramic Beads	MP Biomedicals, LLC.	6540-434
Tissue Homogenizer	MP Biomedicals, LLC.	116004500
Class 1 BioSafety Cabinet	Thermo Scientific	Model 1395