絨毛膜およびビテリン膜の機械的除去:ショ ウジョウバエ 卵母細胞を直接観察するための調製方法

Overview

このビデオでは、以前に固定された成熟した ショウジョウバエの 卵母細胞から絨毛膜およびビテリン膜を機械的に除去する方法について説明します。注目のプロトコルは、蛍光と適合する卵母細胞をその 蛍光ハイブリダイ ゼーションアッセイで得る手順の詳細なデモンストレーションを示す。

Protocol

このプロトコルは、パーキンスとビッケルからの抜粋であり、蛍光を使用して蛍光を使用して、前形および転移Iショウジョウバエ・ウーサイト、J.Vis.(2017).

1. チョリオンとビテリン膜の除去

注: 必要なツールについては 、図 1 を参照してください。

1. 別の後期卵母細胞
   1. 浅い解剖皿に1 mL PBSBTxを加えます。BSAコーティングされた先端を備えたP200を使用して、固定卵巣(約150μL)を浅い皿に移します。ピペット卵巣は、BSAコーティングされたピペットチップで上下に、成熟した卵母細胞を成熟卵母細胞から取り除く。
   2. 後期卵母細胞が十分に分離されたら、全ての組織を500μLマイクロフュージチューブに移します。パスツールピペットを引っ張って余分な液体を取り除き、チューブに約150〜200μLを残します。残りの遺伝子型については、セクション 1.1 を繰り返します。
2. ローリングの準備
   1. PBSBTxの200 μLで深い井戸皿を事前に濡らし、蓋をして脇に置きます。3つやがれたガラススライドを取得し、スライド#3脇に置きます。スライドの曇ったガラス領域を静かにこす#1し、#2一緒に。脱イオン水ですすいでガラスの破片を取り除き、使い捨てワイプで乾燥させます。
   2. 1つのスライドにPBSBTxの50 μLを加え、もう一方のスライドでこの領域をこすることによって、スライド#1と#2のスライドの曇った領域をコーティングします。使い捨てワイプで液体を取り除きます。
   3. 図 2Aに示す構成で、スライドを解剖顕微鏡の下に置きます。スライドの#1と#2の曇り領域を、スライド#3サポートするスライド#2で、接触させておきます。
3. ロール卵母細胞;回転方向が常に直線上にあり、決して円の動きがないことを確認します。
   1. P200ピペットチップをPBSBTxにプレウェットし、上下にピペットを入れてマイクロフュージチューブに卵母細胞を分散させる。卵母細胞を含む液体50 μLをスライド#1の曇ったガラス部分の中央に移します。これを行うためにスライド#2を持ち上げます。
   2. 液体の表面張力が2つの曇ったガラス領域間のシールを作成するまで、スライド#2ゆっくりと下げる。曇った領域をカバーするのに十分な液体があるはずですが、どれも外に出るべきではありません。液体があふれている場合は、引っ張られたパスツールピペットを使用して余分な液体を取り除きます。
   3. 一番下のスライド (#1) を片手で所定の位置に保持し、もう一方の手で上のスライド (#2) を水平方向に前後に移動し、スライド #2 レベルを維持し、スライド #3でサポートします。卵母細胞の動きと進行を容易に視覚化するために顕微鏡の下で行う。
      注: この動きは摩擦を発生させ、卵母細胞を「転がす」原因となり、その振りかたを失います。最小限の圧力を使用する必要があり、動きは短く、迅速でなければなりません。
   4. 水平方向に数回動いた後、わずかに移動角度を変更します(図2B)。複数の増分で、上のスライド(#2)の動きが開始方向に垂直になるまで、この角度を徐々に90°に上げる(図2B)。空の子音は液体に見え、卵子は長く薄く見えます。
   5. ステップ 1.3.3 ~ 1.3.4 を 7 回から 10 回繰り返して、溶液がわずかに曇りになるまで繰り返します。卵母細胞の大部分(75〜85%)が転がるのを止める彼らのビテリン膜を失ったようです。
      注: 特徴的な尖った端は、ビテリン膜を欠いた卵母細胞にしばしば見える。ビテリン膜は、臭素よりも除去するのが難しい。光圧は、バイテリン膜の除去を達成するために転がっている間に上のスライド(スライド#2)に適用され得る。すべての卵母細胞からビテリン膜を除去しようとすると、しばしば他の卵母細胞の破壊をもたらす。
   6. 上のスライド(#2)をそっと持ち上げ、角の1つを下のスライドの曇り領域の中央(#1)までドラッグして、曇った領域の中央に巻き付けた卵母細胞が蓄積するようにします。両方のスライドからPBSBTxを含む深い井戸皿に卵母細胞をすすい。
   7. きれいなスライド#1し、超純水で#2し、使い捨てワイプで乾燥し、リセットします。同じ遺伝子型のすべての卵母細胞がロールされるまで、ステップ1.3.1~1.3.6を繰り返します。これは通常、遺伝子型あたり3〜4ラウンドのローリングを必要とします。
4. 転がった後の破片を取り除く
   1. 15 mLの円錐管に1 mL PBSBTxを加えます。チューブの側面をコーティングするために液体を旋回します。
   2. PBSBTxコーティングされたP1000ピペットチップを使用して、ロール状の卵母細胞をPBSBTxの1mLを含む円錐形チューブに深いウェルディッシュから転がし、卵子を含む円錐管に2mL追加します。
   3. 卵母細胞が底に沈み始め、P1000で破片(イオン、ビテリン など)を含む溶液の上2mLを取り除き、廃棄します。必要に応じて、円錐形のチューブを暗い背景に保持して、不透明な卵母細胞が沈むのを見ます。
   4. 卵母細胞にさらに2 mLのPBSBTxを加え、ステップ1.4.3を繰り返します。1.4.3 を繰り返します。3ラウンドの破片除去の合計のために。
   5. PBSBTxコーティングされたP1000ピペットチップを使用して、卵母細胞を元の500 μLマイクロフュージチューブに戻します。20〜25メスは、転がった成熟卵母細胞の約50μLを得る必要があります。
5. 新鮮な曇りスライド、きれいな深い井戸皿、および各遺伝子型のための新しい円錐形の管を使用して残りの遺伝子型についてセクション4を繰り返す。
6. 保管が必要な場合は、卵母細胞を0.1%TritionX-100で1x PBSに移し、4°Cで一晩保管してください。 ホルムアルデヒド架橋は非イオン性洗剤で逆転できるため、長期保存は推奨されません。

Representative Results

図1:細胞学ツール プロトコルで使用されるツール: (1) 鉗子のペア (#5デュモン);(2) タングステン針;(3)カバー付き深い井戸料理。(4)浅いガラスの解剖皿。(5)パスツールピペットを引っ張った。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:転卵母細胞のスライドの配置と移動(A)プロトコルに記載されているように、卵母細胞の転がりのために設定されたスライドの図。暗い領域は、スライドの曇ったガラス部分を示します。(B)卵母細胞の転がり中のスライド#2の移動ベクトルの方向。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP1600-100	Prepare 10% stock Freeze aliquots
10% Triton X-100	Thermo Scientific	28314	Surfact-Amps
PBSBTx			1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100
Forceps	Dumont		#5 INOX, Biologie
9" Disposable glass Pasteur pipettes	Fisher	13-678-20C	Autoclave to sterilize
Shallow glass dissecting dish			Custom made
Deep well dish (3 wells)	Pyrex	7223-34
Tungsten needle			homemade
Frosted glass slides, 25 x 75 mm	VWR Scientific	48312-002
15 mL conical tubes	Various
500 µl microfuge tubes	Various
Kimwipes	Various		disposable wipes