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PAR-CliP——一种用于鉴定RNA结合蛋白转录组范围结合位点的方法

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DOI：

10.3791/2034

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2010年7月2日

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1Howard Hughes Medical Institute, Laboratory of RNA Molecular Biology, Rockefeller University, 2Berlin Institute for Medical Systems Biology, Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine, 3Biozentrum der Universität Basel and Swiss Institute of Bioinformatics (SIB), 4Biozentrum der Universität Basel and Swiss Institute of Bioinformatics (SIB), 5Genomics Resource Center, Rockefeller University

本文内容

摘要

RNA转录本受到多种反式作用的RNA结合蛋白（RBPs）介导的广泛转录后调控。本文介绍一种可普遍应用的方法，用于精确且在全转录组范围内鉴定RBPs的RNA结合位点。

摘要

RNA转录本通过与数百种RNA结合蛋白（RBPs）以及含microRNA的核糖核蛋白复合物（miRNPs）相互作用，受到转录后基因调控，这些因子的表达通常具有细胞类型依赖性。为了理解这些RNA结合因子之间的相互作用如何影响单个转录本的调控，需要获得高分辨率的体内蛋白-RNA相互作用图谱。 在体内 蛋白质-RNA 相互作用是必需的1.

通常采用遗传学、生物化学和计算方法相结合的方式来鉴定RNA-RBP或RNA-RNP相互作用。通过微阵列分析与免疫纯化的RBP相关的RNA（RIP-Chip）2，可在转录组水平上确定其靶标，但该方法仅适用于动力学上稳定的相互作用的表征，且仅在少数情况下3,4能够识别长靶标RNA内的RBP识别元件（RRE）。更直接的RBP靶位点信息可通过结合体内紫外线交联5,6与免疫沉淀7-9，随后分离交联的RNA片段并进行cDNA测序（CLIP）10获得。CLIP已被用于鉴定多种RBP的靶标11-17。然而，CLIP受限于254 nm紫外线介导的RNA-蛋白质交联效率较低，且在测序所得的交联片段中难以精确定位交联位点，因此很难将紫外交联的靶标RNA片段与样品中同时存在的大量非交联背景RNA片段区分开来。

我们开发了一种强大的基于细胞的交联方法，可高分辨率、全转录组范围地确定细胞内RNA结合蛋白（RBPs）和含microRNA的核糖核蛋白复合物（miRNPs）的结合位点，该方法称为PAR-CliP（光活化核糖核苷增强交联与免疫沉淀）（方法示意图见图1A）。该方法依赖于活细胞将光反应性核糖核苷类似物（如4-硫代尿苷（4-SU）和6-硫代鸟苷（6-SG））掺入新生RNA转录本中。使用365 nm紫外光照射细胞，可高效诱导带有光反应性核苷标记的细胞RNA与其相互作用的RBPs发生交联。随后对目标RBP进行免疫沉淀，并分离交联及共沉淀的RNA。分离得到的RNA被转化为cDNA文库，并利用Solexa技术进行深度测序。通过PAR-CliP构建的cDNA文库的一个显著特征是，可通过测序所得cDNA中的突变精确定位交联位点。使用4-SU时，交联序列中会出现胸腺嘧啶向胞嘧啶的转换；而使用6-SG则会导致鸟苷向腺苷的突变。这些交联序列中突变的存在，使得能够将其与来源于大量细胞RNA的背景序列有效区分开来。

该方法已应用于多种不同的RNA结合蛋白，相关研究由Hafner等人报道 等人18

方案

以下方案描述了在多西环素诱导下表达FLAG/HA标签IGF2BP1的HEK293细胞的PAR-CliP实验步骤。我们将使用抗FLAG抗体进行免疫沉淀。

如果存在可用于免疫沉淀的高效抗体，PAR-CliP 可适用于任何表达可检测水平的内源性、无标签目标 RNA 结合蛋白（RBP）的细胞系。

扩增细胞

  1. 在生长培养基中扩增 FlpIn-HEK293/TO/FLAG/HA-IGF2BP1 细胞。建议起始使用 100–400 × 106 个细胞（约 10–40 个 15 cm 细胞培养皿）。将细胞培养至约 80% 汇合度。
  2. 交联前 14 小时，向细胞培养基中直接加入：a) 4-硫代尿苷，终浓度为 100 μM（按 1:1000 v/v 加入 1 M 4-硫代尿苷储存液）；b) 通过加入 1 μg/ml 多西环素（按 1:10,000 v/v 加入 10 mg/ml 多西环素储存液）诱导表达 FLAG/HA 标记的 IGF2BP1。注：可使用 100 μM 的 6-硫代鸟苷替代 4-硫代尿苷。

紫外交联

  1. 每块培养板用 10 ml 冰冷的 PBS 洗涤一次，并彻底去除 PBS。
  2. 将培养板置于冰上，使用 Stratalinker 2400（Stratagene）或类似设备，以 365 nm 紫外光在无盖条件下照射，剂量为 0.15 J/cm2。
  3. 每块培养板加入 1 ml PBS，用橡胶刮棒刮下细胞，转移至 50 ml 离心管中，在 4°C 下以 500 × g 离心 5 分钟收集细胞沉淀，并弃去上清液。100 × 106 个 HEK293 细胞（10 块 15 cm 培养板）可获得约 1 ml 湿细胞沉淀。
  4. （可选）若不立即进行细胞裂解，可将细胞沉淀在液氮中速冻，并于 -80°C 保存。细胞沉淀可保存至少 12 个月。

细胞裂解与RNaseT1消化

  1. 将交联细胞的细胞沉淀重悬于3倍体积的1× NP40裂解缓冲液中，冰上孵育10分钟。
  2. 在4°C下以13,000 × g离心15分钟，澄清细胞裂解液。
  3. 使用0.2 μm膜针头过滤器（Pall Acrodisc或同等产品）过滤裂解液，进一步澄清。
  4. 加入RNase T1（Fermentas，10,000 U/μl），使终浓度为1 U/μl，在22°C水浴中孵育15分钟。随后在冰上冷却5分钟，再进行下一步操作。

交联靶标RNA片段的免疫沉淀与回收

使用磁力分离器

在样品制备过程中，请遵循以下指南，以防止磁珠干燥。

  1. 将含有磁珠的离心管置于磁力架上静置 1–2 分钟。
  2. 当离心管处于磁力分离器上时，向管中加入缓冲液。
  3. 盖紧管盖，从磁力分离器上取下离心管，并重悬磁珠。可通过用手指轻弹管壁或使用旋涡振荡器（设定为 5–6 档）进行重悬。
  4. 短暂离心，以收集可能残留在管盖中的磁珠。
  5. 根据需要重复步骤 1 至 4。

磁珠的制备

  1. 每毫升细胞裂解液取10 μl Dynabeads Protein G磁性微粒（Invitrogen），典型实验中约为40–50 μl微珠，转移至1.5 ml微量离心管中。用1 ml柠檬酸-磷酸盐缓冲液洗涤微珠两次。
  2. 用相当于原始微珠悬液体积两倍的柠檬酸-磷酸盐缓冲液重悬微珠。
  3. 每毫升悬液加入0.25 μg抗FLAG M2单克隆抗体（Sigma），于室温在旋转仪上孵育40分钟。
  4. 用1 ml柠檬酸-磷酸盐缓冲液洗涤微珠两次，以去除未结合的抗体。
  5. 用相当于原始微珠悬液体积两倍的柠檬酸-磷酸盐缓冲液重悬微珠。

免疫沉淀（IP）、第二次RNase T1消化及去磷酸化

  1. 每毫升经部分RNase T1处理的细胞裂解液中加入20 μl新配制的抗体偶联磁珠，在15 ml离心管中4°C旋转孵育1小时。
  2. 使用磁性粒子收集器（Invitrogen）收集15 ml和50 ml离心管中的磁珠，并转移至1.5 ml微量离心管中。
  3. 用1 ml免疫沉淀洗涤缓冲液洗涤磁珠3次。
  4. 加入RNaseT1（Fermentas，10,000 U/μl），使终浓度为100 U/μl，将磁珠悬液在22°C水浴中孵育15分钟，随后在冰上冷却5分钟。
  5. 用1 ml高盐洗涤缓冲液洗涤磁珠3次。
  6. 用一体积去磷酸化缓冲液重悬磁珠。
  7. 加入小牛肠碱性磷酸酶（CIAP，NEB），使终浓度为0.5 U/μl，在37°C孵育10分钟。
  8. 用1 ml磷酸酶洗涤缓冲液洗涤磁珠两次。
  9. 用不含DTT的多核苷酸激酶（PNK）缓冲液洗涤磁珠两次（酶促反应所需的DTT浓度足以损伤磁珠）。
  10. 用相当于原始磁珠体积的PNK缓冲液重悬磁珠。

对与免疫沉淀蛋白交联的RNA片段进行放射性标记

  1. 向上述磁珠悬液中加入 Υ-32P-ATP，使其终浓度为 0.5 μCi/μl，并加入 T4 PNK（NEB），使其终浓度为 1 U/μl，总体积为一个原始磁珠体积。在 37°C 下孵育 30 分钟。
  2. 加入非放射性 ATP，使其终浓度为 100 μM，并在 37°C 下继续孵育 5 分钟。
  3. 用不含 DTT 的 PNK 缓冲液将磁珠洗涤 5 次，每次 800 μl。
  4. 将磁珠重悬于 70 μl 的 SDS-PAGE 上样缓冲液中。

从凝胶切片中对交联的RNA-蛋白质复合物进行SDS-PAGE及电洗脱

  1. 将放射性标记的悬液置于95°C的加热块中孵育5分钟，以变性并释放免疫沉淀的与RNA交联的RBP，随后涡旋振荡。
  2. 从磁力架上移除磁珠，并将上清液转移至一支洁净的1.5 ml微量离心管中。
  3. 每孔上样40 μl上清液至Novex Bis-Tris 4-12%（Invitrogen）预制聚丙烯酰胺凝胶，于200 V电压下电泳55分钟。
  4. 拆卸电泳槽并分离凝胶，保留凝胶附着于一块玻璃板上。为便于将凝胶与磷屏成像结果对齐，建议在凝胶四个角中的三个角不对称地植入三小块具放射性的凝胶碎片。这些放射性凝胶碎片可来自先前用于纯化放射性标记合成寡核苷酸的凝胶。用塑料膜（例如Saran wrap）包裹凝胶，以防污染。
  5. 将凝胶暴露于已擦除背景信号的磷屏成像屏1小时，并使用磷屏成像仪进行检测。
  6. 根据植入的凝胶碎片定位，将凝胶与磷屏成像图谱对齐。切下对应于预期RBP大小（IGF2BP1，约75 kDa）的条带，转移至D-Tube Dialyzer Midi管中，并加入800 μl 1x SDS电泳缓冲液。
  7. 在1x SDS电泳缓冲液中，于100 V电压下电洗脱2小时，以回收从凝胶中切下的交联RNA-RBP复合物。具体操作按照Novagen公司D-Tube Dialyzer Midi（Novagen）产品说明书，在800 μl SDS电泳缓冲液中进行电洗脱。

蛋白酶K消化

  1. 向电洗脱液中加入等体积的2×蛋白酶K缓冲液，然后加入蛋白酶K（Roche），使其终浓度为1.2 mg/ml。在55°C下孵育30分钟。
  2. 通过酸性酚/氯仿/IAA（25:24:1，pH 4.0）抽提，随后进行氯仿抽提来回收RNA。加入1 μl甘油原（10 mg/ml储存液），再加入3倍体积的乙醇沉淀RNA。将沉淀溶解于10.5 μl水中。

cDNA文库制备与深度测序

将回收的RNA按照最初用于克隆小调控RNA的标准化cDNA文库构建方案进行操作19。第一步为3'接头连接，在20 μl体系中进行，使用10.5 μl回收的RNA，具体操作如前所述。使用所述的Solexa测序接头引物组。根据回收RNA的量不同，在cDNA扩增后可能会检测到不含插入片段的5'-接头-3'-接头产物，表现为额外的PCR条带。在此情况下，从3% NuSieve低熔点琼脂糖凝胶中切下预期大小的较长PCR产物，利用GelElute试剂盒（Qiagen）从凝胶片段中洗脱PCR产物，并使用Solexa技术进行测序。一次Solexa测序运行通常可获得600万至1000万条序列读长，足以实现对RNA结合蛋白结合位点的全转录组覆盖。

生物信息学分析

必须对测序读段进行严谨的生物信息学分析，以深入了解所研究RNA结合蛋白（RBP）的RNA结合位点特征，例如RNA识别元件、RBP偏好的结合区域（外显子区与内含子区、编码序列与非翻译序列）。测序读段需比对至基因组和EST数据库。我们通常选用在基因组上唯一比对且最多允许一个错配、插入或缺失的读段，构建读段簇，以便进一步分析。在聚类后的测序读段中，若存在特征性突变——使用4-SU时表现为T到C的转换，使用6-SG时表现为G到A的转换——则提示这些序列为成功交联的序列。根据我们的经验，未交联但标记了4-SU的RNA其背景突变率约为20%，而在交联后该比率上升至约50-80%。

有关生物信息学分析的详细描述可参见 Hafner et al.18 发表文章的补充材料

可选步骤

测定4-硫代尿苷掺入总RNA的水平

在收获前16小时，在培养基中添加100 μM 4SU，培养稳定表达目标RBP的细胞系，然后从中分离总RNA。作为对照，收获未添加4SU的细胞。通过向洗涤后的细胞沉淀中加入3倍体积的Trizol试剂（Sigma），按照制造商说明书操作，分离总RNA。进一步使用Qiagen RNeasy试剂盒，根据制造商方案对总RNA进行纯化。为防止4SU在RNA分离和分析过程中被氧化，需在洗涤缓冲液及后续的酶促反应步骤中添加0.1 mM二硫苏糖醇（DTT）。将总RNA消化并去磷酸化为单核苷，用于HPLC分析，方法如前所述20。简言之，在30 μl反应体系中，将40 μg纯化的总RNA与0.4 U细菌碱性磷酸酶（Worthington Biochemical）和0.09 U蛇毒磷酸二酯酶（Worthington Biochemical）在37°C孵育16小时。使用合成的4SU标记RNA作为参考标准品（我们通常使用CGUACGCGGAAUACUUCGA(4SU)U），同样对其进行完全酶解。采用Supelco Discovery C18反相柱（键合相硅胶，5 μM粒径，250 × 4.6 mm，美国宾夕法尼亚州贝尔丰特）对所得核糖核苷混合物进行HPLC分离。HPLC流动相为含3%乙腈的0.1 M四乙基乙酸铵溶液（A）和含90%乙腈的水溶液（B）。采用等度梯度洗脱程序：0% B保持15分钟，0至10% B在20分钟内完成，10至100% B在30分钟内完成。每次运行之间施加5分钟100% B的冲洗步骤，以清洗HPLC柱。

代表性结果

蛋白质电泳凝胶经UV处理，显示以kDa为单位的分子量，HA免疫印迹。
图1（右侧面板）显示了使用表达FLAG/HA标记IGF2BP1的细胞系并加入4-SU和6-SG进行PAR-CliP实验的代表性结果。请注意，6-SG对IGF2BP1的交联效率低于4-SU的交联效率。较低的交联效率将导致来自高丰度细胞RNA片段的背景序列增加，因此在使用交联效率较低的光反应性核苷酸时，应考虑放大实验规模。

图1的左侧面板展示了使用不同光反应性尿苷类似物与传统254 nm紫外交联相比在PAR-CliP中应用的比较。

正确长度的放射性条带强度可以很好地反映PAR-CliP实验是否成功，以及是否已分离到足够用于小RNA测序流程的RNA量（小RNA测序的cDNA文库构建分步操作详见19）。测序读段中特征性突变的频率，即使用4-SU时的T到C转换和使用6-SG时的G到A转换，是RNA与蛋白成功交联的标志。根据我们的经验，未交联但标记了4-SU的RNA其背景突变率约为20%，而交联后该比率可升至约50-80%。

披露

T.T. 是 Alnylam Pharmaceuticals 的联合创始人及科学顾问，同时担任 Regulus Therapeutics 的顾问。

致谢

我们感谢Tuschl实验室成员的有益讨论。M.H. 由德国学术交流中心（DAAD）提供资助。本工作由瑞士国家科学基金（Swiss National Fund）资助项目#3100A0-114001支持，授予M.Z.；T.T. 是霍华德·休斯医学研究所（HHMI）研究员，其实验室的工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目GM073047、MH08442以及Starr基金会的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论

缓冲液与试剂

生长培养基 HEK293 细胞

  • DMEM
  • 10% FBS
  • 2 mM L-谷氨酰胺
  • 100 U/ml 青霉素
  • 100 U/ml 链霉素
  • 100 μg/ml 潮霉素
  • 15 μg/ml 脱羧酶

4-硫代尿苷储备液（1 M）

  • 260.27 mg 4-硫代尿苷
  • 1 ml DMSO

多西环素储备液（10 mg/ml）

  • 10 mg 多西环素
  • 1 ml DMSO

1x NP40 裂解缓冲液

配制不含 DTT 和蛋白酶抑制剂的 5 倍缓冲液母液。在实验前直接加入 DTT 和蛋白酶抑制剂。

  • 50 mM HEPES，pH 7.5
  • 150 mM KCl
  • 2 mM EDTA
  • 1 mM NaF
  • 0.5% (v/v) NP40
  • 0.5 mM DTT
  • 完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物（Roche）

柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液

  • 4.7 g/l 柠檬酸
  • 9.2 g/l Na2人类表型本体4
  • pH 5.0

免疫沉淀洗涤缓冲液

  • 50 mM HEPES-KOH，pH 7.5
  • 300 mM KCl
  • 0.05% (v/v) NP40
  • 0.5 mM DTT（实验前直接加入）
  • 完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物（Roche）（在实验前直接加入）

高盐洗涤缓冲液

  • 50 mM HEPES-KOH，pH 7.5
  • 500 mM KCl
  • 0.05% (v/v) NP40
  • 0.5 mM DTT（实验前直接加入）
  • 完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物（Roche）（在实验前直接加入）

去磷酸化缓冲液

  • 50 mM Tris-HCl，pH 7.9
  • 100 mM NaCl
  • 10 mM MgCl2
  • 1 mM DTT

磷酸酶洗涤缓冲液

  • 50 mM Tris-HCl，pH 7.5
  • 20 mM EGTA
  • 0.5% (v/v) NP40

不含DTT的多核苷酸激酶（PNK）缓冲液

  • 50 mM Tris-HCl，pH 7.5
  • 50 mM NaCl
  • 10 mM MgCl2

PNK缓冲液

  • 50 mM Tris-HCl，pH 7.5
  • 50 mM NaCl
  • 10 mM MgCl2
  • 5 mM DTT

SDS-PAGE 上样缓冲液

  • 10% 甘油（v/v）
  • 50 mM Tris-HCl，pH 6.8
  • 2 mM EDTA
  • 2% SDS（w/v）
  • 100 mM DTT
  • 0.1% 溴酚蓝

2x 蛋白酶K缓冲液

  • 100 mM Tris-HCl，pH 7.5
  • 150 mM NaCl
  • 12.5 mM EDTA
  • 2%（w/v）SDS

参考文献

  1. Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat. Rev. Genet. 8 (7), 533-533 (2007).
  2. Tenenbaum, S. A. Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays. Proc. Nat. Acad. Sci. 97 (26), 14085-14085 (2000).
  3. Gerber, A. P. Genome-wide identification of mRNAs associated with the translational regulator PUMILIO in Drosophila melanogaster. Proc. Nat. Acad. Sci. 103 (12), 4487-4487 (2006).
  4. Lopez de Silanes, I. Identification of a target RNA motif for RNA-binding protein HuR. Proc. Nat. Acad. Sci. 101 (9), 2987-2987 (2004).
  5. Greenberg, J. R. Ultraviolet light-induced crosslinking of mRNA to proteins. Nucl. Acids Res. 6 (2), 715-715 (1979).
  6. Wagenmakers, A. J. Cross-linking of mRNA to proteins by irradiation of intact cells with ultraviolet light. Eur. J. Biochem. 112 (2), 323-323 (1980).
  7. Mayrand, S. Structure of nuclear ribonucleoprotein: identification of proteins in contact with poly(A)+ heterogeneous nuclear RNA in living HeLa cells. The Journal of Cell Biology. 90 (2), 380-380 (1981).
  8. Dreyfuss, G. Characterization of heterogeneous nuclear RNA-protein complexes in vivo with monoclonal antibodies. Mol. Cell. Biol. 4 (6), 1104-11 (1984).
  9. Adam, S. A., Dreyfuss, G. Adenovirus proteins associated with mRNA and hnRNA in infected HeLa cells. J. Virol. 61 (10), 3276-3276 (1987).
  10. Ule, J. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302 (5648), 1212-1212 (2003).
  11. Licatalosi, D. D. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-464 (2008).
  12. Yeo, G. W. An RNA code for the FOX2 splicing regulator revealed by mapping RNA-protein interactions in stem cells. Nat. Struct. Mol. Biol. 16 (2), 130-130 (2009).
  13. Sanford, J. R. Splicing factor SFRS1 recognizes a functionally diverse landscape of RNA transcripts. Genome Res. 19 (3), 381-381 (2009).
  14. Granneman, S. Identification of protein binding sites on U3 snoRNA and pre-rRNA by UV cross-linking and high-throughput analysis of cDNAs. Proc. Nat. Acad. Sci. , (2009).
  15. Guil, S., Caceres, J. F. The multifunctional RNA-binding protein hnRNP A1 is required for processing of miR-18a. Nat. Struct. Mol. Biol. 14 (7), 591-591 (2007).
  16. Chi, S. W. Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps. Nature. 460 (7254), 479-479 (2009).
  17. Zisoulis, D. G. Comprehensive discovery of endogenous Argonaute binding sites in Caenorhabditis elegans. Nat. Struct. Mol. Biol. , (2010).
  18. Hafner, M. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. , (2010).
  19. Hafner, M. Identification of microRNAs and other small regulatory RNAs using cDNA library sequencing. Methods. 44 (1), 3-3 (2008).
  20. Andrus, A., Kuimelis, R. G. Base composition analysis of nucleosides using HPLC. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. Chapter 10 (Unit 10.6), (2001).

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