Summary
Toxoplasma gondii wordt omgezet in een cyste formulier in reactie op belasting van het milieu, die kunnen worden nagebootst in weefselkweek modellen. Deze video demonstreert technieken om cyste wand vorming van onderzoeken door het activeren van beenmerg afgeleide macrofagen of het wijzigen van groeimedium pH in fibroblast cellen.
Abstract
Toxoplasma gondii is een obligaat intracellulaire parasiet dat elke kern cel van warmbloedige dieren kunnen binnenvallen. Tijdens de infectie, T. gondii verspreidt als een snel repliceren vorm genaamd de tachyzoite. Tachyzoites om te zetten in een langzaam groeiende ingekapseld vorm genaamd de bradyzoite door een signalering proces dat niet goed is gekarakteriseerd. Binnen de dieren, zijn bradyzoite cysten gevonden in het centrale zenuwstelsel en spierweefsel en vormen de chronische fase van de infectie. Conversie naar bradyzoites gesimuleerd kan worden in weefselkweek door CO 2 verhongering, met behulp van een medium met een hoge pH-waarde, of de toevoeging van interferon-gamma (IFNy). Bradyzoites worden gekenmerkt door de aanwezigheid van een cyste wand, waarop de lectine Dolichos biflorus agglutinine (DBA) bindt. Fluorescent gelabelde DBA wordt gebruikt om de cyste muur in parasieten gekweekt in menselijke voorhuid fibroblasten (HFFS) die zijn blootgesteld aan lage CO 2 en een hoge pH medium te visualiseren. Ook parasieten die in muizen beenmerg afgeleide macrofagen (BMMs) display een cyste wand detecteerbaar door DBA na de BMMs worden geactiveerd met IFNy en lipopolysaccharide (LPS). Dit protocol zal aantonen hoe de conversie van T. te induceren gondii naar bradyzoites met behulp van een hoge pH groeimedium met een lage CO 2 en activering van BMMs. Gastheercellen worden gekweekt op dekglaasjes, besmet zijn met tachyzoites en ofwel geactiveerd met toevoeging van IFNy en LPS (BMMs) of blootgesteld aan een hoge pH groeimedium (HFFS) voor drie dagen. Na voltooiing van infecties, zal gastheercellen worden vastgesteld, gepermeabiliseerde, en geblokkeerd. Cyste wanden zullen worden gevisualiseerd met behulp van rhodamine DBA met fluorescentie microscopie.
Protocol
1. De voorbereiding van de menselijke voorhuid fibroblasten (HFF)-gecoate dekglaasjes
- Plaats een steriele ronde glazen dekglaasje op de bodem van de wells van een 24-well weefselkweek plaat.
- Om de oogst HFFS van een confluente 150 cm 2 fles, twee keer spoel de kolf met 1X PBS en voeg 2,5 ml van 0,025% trypsine-EDTA. Incubeer kolf bij 37 ° C gedurende 5-10 minuten.
- Door op de zijkant van de kolf tegen de palm van je hand kan helpen bij het verwijderen van de cellen van de kolf. Zodra cellen hebben vrijgelaten uit de fles, voeg 150 ml van HFF-medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM] met 10% FBS, 2 mM L-glutamine, en 1% penicilline-streptomycine) en gebruik het medium om de af te spoelen en het verzamelen van de cellen.
- Doseer 1 ml van cellen per putje met de dekglaasjes.
- Laat cellen om samenvloeiende worden bij 37 ° C, 5% CO 2.
2. Voorbereiden L929 geconditioneerd medium (CM) voor BMC ontwikkeling
- L929 is een murine aneuploïde fibrosarcoom cellijn die macrofaag kolonie stimulerende factor afscheidt na lange periodes van confluentie. Deze afscheiding kan de CM van L929 cellen die worden gebruikt om beenmergcellen van de muis te ontwikkelen tot macrofagen in celcultuur 1.
- Zodra L929 cellen zijn confluent, laat ze uitbroeden voor een extra 7-9 dagen totdat ze lijken sferische en beginnen tillen uit de kolf. Verzamel supernatant en pellet eventuele vrijstaande cellen bij 425 xg gedurende 10 minuten. Dit supernatant is de CM.
- Een 150 cm 2 fles van L929 cellen levert 30 ml van de CM, die 150 ml van BMC medium genereert. BMC medium is samengesteld uit 10% FBS, 20% CM, 1% penicilline-streptomycine, en 1% L-glutamine in DMEM.
3. Isolatie van beenmerg en celcultuur van BMCS
- Offer een C57BL / 6 muis door CO 2 stikken en het oppervlak steriliseren met 70% ethanol.
- Expose het buikvlies door het optillen van de buikhuid in de buurt van het been en snijden met een schaar. Vermijd het aanprikken van de buikholte. Gekapt om het been naar het scheenbeen en het dijbeen bloot te leggen. Gesneden spierweefsel uit het been botten met een schaar.
- Aan het dijbeen te verwijderen, snij een keer onder de knie en een keer in de buurt van de heup. Leg de botten in een bacteriologische petrischaal met koud 1X PBS. Gebruik geen tissue cultuur behandeld petrischalen voor deze stappen, omdat de BMCS permanent hechten. Gebruik een scalpel te schrapen eenmalige extra spierweefsel. Snijd het bot net boven de knie tot aan het merg bloot te leggen.
- Herhaal de stappen (b) en (c) om beenmerg te verzamelen van de tweede dijbeen.
- Gebruik een 10cc injectiespuit gevuld met koud 1X PBS en een 25 gauge naald om het beenmerg los in een 50 ml conische buis. Het bot zou moeten verschijnen zuiver wit zodra beenmerg wordt verwijderd.
- Passeer de PBS / merg mengsel door een 22 gauge naald te breken elke beenmerg aggregaten.
- Draai het mengsel bij 425 xg gedurende 10 minuten, en verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de pellet in 8 ml van BMC medium. Voeg 1 ml celsuspensie en 9 ml BMC middellange tot 8 bacteriologische petrischalen.
- Incubeer bij 37 ° C, 5% CO 2.
- Op dag 5, voeg 10 ml BMC medium om elk bord. Op dag 7, zullen de cellen volledig ontwikkeld. BMCS kan worden gepasseerd voor 1-2 weken na de rijping.
- Op te splitsen BMCS, verwijder het medium en voeg 5 ml koud 1X PBS aan elke petrischaal. Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 minuten, totdat de cellen beginnen op te tillen. Spoel de BMCS uit de plaat met een steriele pipet overdracht.
- Het zwembad van het BMCS in een 50 ml conische buis en pellet bij 425 xg gedurende 10 minuten.
- Resuspendeer de pellet in 10 ml BMC medium en rekenen op een hemocytometer. Zaad 2x105 BMCS per putje in een 24-well plaat met ronde glazen dekglaasjes op de bodem. Laat de BMCS 's nachts hechten alvorens besmetten met T. gondii. Overtollige BMCS kan worden reseeded op petrischaaltjes voor later gebruik.
4. Infecteren cellen met T. gondii
- Infect 25 cm 2 fles die confluente HFFS met 2x10 6 T. gondii en groeien tot cellen beginnen te lyseren (ongeveer 2-3 dagen).
- Gebruik een cel schraper om de geïnfecteerde gastheercel monolaag te verwijderen uit de weefselkweek fles en laat de parasieten van de host cellen door het passeren van de losgekomen monolaag door middel van een 27-gauge naald.
- Gebruik een hemocytometer om het aantal parasieten te bepalen in het medium.
- Infect 10 5 parasieten per goed met dekglas van HFF-monolagen van Protocol nr. 1, of BMCS van Protocol nr. 3. Laat de parasieten binnen te vallen gedurende 3 uur bij 37 ° C, 5% CO 2.
5. Initiëren T. gondii bradyzoite ontwikkeling door milieu-invloeden
- Bradyzoite ontwikkeling in HFFS met gemiddelde pH-waarde te verhogen en de CO 2 honger
- Bereid ontwikkeling medium. Ontwikkeling medium bevat RPMIk heb 1640 zonder bicarbonaat, 1% FBS, 1% penicilline-streptomycine, en 42 mM HEPES. pH tot 8,0 en filter steriliseren.
- Verwijderen van geïnfecteerde DMEM HFFS, spoelen met 1X PBS en voeg 1 ml van de ontwikkeling medium.
- Incubeer gedurende 3 dagen bij 37 ° C met de omgevingslucht.
- Activering van BMCS
- Bereid medium tot BMCS te activeren. Activering medium is BMC medium aangevuld met IFN-γ 100U/ml en 100 ng / ml LPS. Sonificeer LPS in een waterbad gedurende 2 minuten voor gebruik om de aggregaten te verstoren.
- Verwijder de BMC medium van putten en te vervangen door 1 ml van de activering medium.
- Incubeer bij 37 ° C, 5% CO 2 voor 3 dagen.
6. Immunofluorescentie detectie
- Spoel besmette putjes drie keer met 1X PBS.
- Bevestig de monolaag met 200ul van 3% formaldehyde gedurende 20 minuten.
- Verwijder fixatief en spoel putten met 1X PBS.
- Voeg 200μl van 0,1 M glycine om putten en laat zitten voor 5 minuten.
- Verwijder de glycine en spoel putten met 1X PBS.
- Voeg 250 ul van 3% BSA/0.2% TritonX-100 in 1X PBS tot permeabilize en blokkeren de monolaag gedurende 30 minuten.
- Verwijder de blokkering oplossing en spoel putten met 1X PBS.
- Voeg 50 ul van een 1:250 verdunning van rhodamine Dolichos biflorus agglutinine in 3% BSA/0.2% Triton X-100 in 1X PBS.
- Afdekplaat en plaats op het platform van shaker bij kamertemperatuur gedurende 1 uur
- Was de dekglaasjes 3 keer met 0,2% Triton X-100 in 1X PBS gedurende 5 minuten op een platform shaker.
- Mount coverslips gebruik VectaShield montage medium met 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
- Stained T. gondii kan worden gevisualiseerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop met een filter geschikt is voor rhodamine bij een vergroting van 100x.
7. Representatieve resultaten
Figuur 1 toont vertegenwoordiger DBA kleuring van T. gondii in geactiveerde BMMs en HFFS onder pH stress. Beide tonen DBA vlekken rond parasiet met vacuolen, wijst op de aanwezigheid van de cyste wand componenten. De geactiveerde BMM afbeelding toont DBA kleuring die in overeenstemming is met het oppervlak van de vacuole. De doorsnede van T. gondii in pH benadrukte HFFS toont de cyste wand met geen interne structuren gekleurd.
Figuur 1. DBA kleuring van benadrukte T. gondii. intracellulaire parasieten onder stress omstandigheden, geactiveerd BMMs of pH benadrukt HFFS, werden gekleurd met rhodamine geconjugeerde DBA (rood). Differentieel interferentie contrast (DIC) toont de contouren van de cyste en de zwarte schaalbalk is gelijk aan 2 uM.
Experimenten op dieren
Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en regelgeving weer door de Universiteit van Wisconsin Animal Care en gebruik Comite.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel het mechanisme van bradyzoite ontwikkeling is niet volledig begrepen, moleculair genetische analyses van T. gondii stadium conversie in weefselkweek heeft geleid tot de ontdekking van genen die betrokken zijn bij bradyzoite cyste vorming van 2,3,4. De analyses ook geleid tot de observatie dat sommige bradyzoite markers zijn uitgedrukt in andere langdurige stress voorwaarden, waaronder de groei van geactiveerde macrofagen 5,6. De bovenstaande methoden wordt beschreven hoe T. groeien gondii en induceren de ontwikkeling een DBA positief cyste wand-structuur in beide BMCS en HFFS. Deze resultaten benadrukken dat de cyste ontwikkelingstraject kan worden geïnduceerd door verschillende stress-stimuli.
Omdat T. gondii kan groeien in vrijwel elke kernhoudende cel van warmbloedige gastheer, kunnen veel soorten cellen worden gebruikt om te groeien T. gondii in vitro. HFFS werden gebruikt in dit protocol, omdat ze een contact geremd cellijn. Sinds celkweek bradyzoite ontwikkeling duurt drie dagen, is het makkelijker om te gebruiken cellijnen die niet zal overwoekeren. HFFS zijn primaire cellen die niet voor onbepaalde tijd kan worden gekweekt. Hoe langer HFFS zijn passage in weefselkweek, hoe minder tolerant ze te hoge pH medium, en dus hoe minder ze worden onbruikbaar voor bradyzoite schakelen. Voor optimale resultaten dient de gastheercellen worden lage doorgang en mag op zijn minst een week rust nadat ze confluent. Er zijn alternatieve methoden voor het opwekken van ontwikkeling tot bradyzoites dat verschillende effecten op de gastheercel 7 hebben.
T. gondii gedijt in vele immuun celtypen. Voor sommige toepassingen, BMCS te verkiezen zijn boven cellijnen macrofagen, omdat ze te vermijden artefacten die zijn geïntroduceerd door immortalisatie 8. BMCS zijn ook nuttig voor in vitro experimenten, omdat ze hebben een platte morfologie ten opzichte van RAW264.7 cellen, waardoor ze meer vatbaar voor microscopie. De basis BMC cultuur hier beschreven methode kan worden aangepast voor andere doeleinden, waaronder de productie van BMCS van andere muizenstammen 9,10. De mate van activatie gezien met IFNy en LPS kunnen verschillen afhankelijk van de leverancier en zelfs de partij. Daarom is het noodzakelijk de bedragen van LPS en IFNy gebruikt in de activering medium voor een optimale en consistente prestaties titreren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Universiteit van Wisconsin-Madison Herman I. Shapiro Distinguished Graduate Fellowship (CMT), NIH award AI072817 (AMP) en de American Heart Association Award 0840059N (LJK).Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | GIBCO, by Life Technologies | 11960-051 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | heat inactivate |
| Rhodamine Dolichos biflorus agglutinin | Vector Laboratories | RL-1032 | |
| Formaldehyde (16%) | Polysciences, Inc. | 18814 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | |
| IFNγ | PeproTech Inc | 315-05 | Store in single use aliquots |
| L-glutamine (200mM) | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma-Aldrich | L4391-1MG | Store in single use aliquots |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| RPMI medium 1640 powder (with L-glutamine, without bicarbonate) | GIBCO, by Life Technologies | 31800-022 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | GIBCO, by Life Technologies | 25200 | |
| VectaShield mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Tomida, M., Yamamoto-Yamaguchi, Y., Hozumi, M. Purification of a factor inducing differentiation of mouse myeloid leukemic M1 cells from conditioned medium of mouse fibroblast L929 cells. J Biol Chem. 259 (17), 10978-10980 (1984).
- Matrajt, M., Donald, R. G., Singh, U., Roos, D. S. Identification and characterization of differentiation mutants in the protozoan parasite Toxoplasma gondii. Mol Microbiol. 44, 735-747 (2002).
- Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction. Mol Microbiol. 44, 721-733 (2002).
- J, P., Knoll, L. J. Isolation of Toxoplasma gondii development mutants identifies a potential proteophosphogylcan that enhances cyst wall formation. Molecular and Biochemical Parasitology. 169 (2), 120-123 (2010).
- Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Induction of Bradyzoite-Specific Toxoplasma gondii Antigens in Gamma Interferon-Treated Mouse Macrophages. Infection and Immunity. 61 (3), 1141-1145 (1993).
- Ibrahim, H. M., Bannai, H., Xuan, X., Nishikawa, Y. Toxoplasma gondii Cyclophilin 18-Mediated Production of Nitric Oxide Induces Bradyzoite Conversion in a CCR5-Dependent Manner. Infection and Immunity. 77 (9), 3686-3695 (2009).
- Lyons, R. E., McLeod, R., Roberts, C. W.
- Berghaus, L. J., Moore, J. N., Hurley, D. J., Vandenplas, M. L., Fortes, B. P., Wolfert, M. A., Boons, G. J. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors 2, 3, and 4. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. , (2009).
- Mordue, D. G., Scott-Weathers, C. F., Tobin, C. M., Knoll, L. J. A patatin-like protein protects Toxoplasma gondii from degradation in activated macrophages. Mol Microbiol. 63 (2), 482-496 (2007).
- Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Reduced replication of Toxoplasma gondii is necessary for induction of bradyzoite-specific antigens: a possible role for nitric oxide in triggering stage conversion. Infection and Immunity. 62 (5), 1761-1777 (1994).
