Multicolor Zeitraffer-Imaging transgener Zebrafische: Visualisierung von Retinal Stammzellen durch gezielte Nervenzellen Ablation Activated

Summary

In diesem Video werden Techniken für multicolor konfokalen Zeitraffer-Imaging-und Zielzelle Ablation zur Verfügung gestellt. Zeitraffer-Imaging wird verwendet, um das Verhalten der verschiedenen Zelltypen des Interesses zu überwachen

Abstract

Hochauflösende Zeitraffer-Imaging lebender Zebrafischlarven kann genutzt werden, um zu visualisieren, wie biologische Prozesse entfalten (für eine Übersicht siehe ^1). Compound transgene Fische, die verschiedenen fluoreszierenden Reporter Express in benachbarten Zelltypen bieten eine Möglichkeit, folgende zellulären Interaktionen ² und / oder Gewebe-Ebene Antworten auf experimentelle Manipulationen im Laufe der Zeit. In diesem Video zeigen wir Methoden, die für die Bildgebung mehrere transgen bezeichnet Zelltypen verwendet werden können seriell in den einzelnen Fisch im Laufe der Zeit Kurse, die von einigen Minuten bis zu mehreren Tagen erstrecken kann. Die beschriebenen Techniken gelten für alle Studie versucht, das "Verhalten" der benachbarten Zellen-Typen im Laufe der Zeit zu korrelieren, darunter: 1) Serie "catch and release"-Methoden für die Bildgebung eine große Anzahl von Fischen über mehrere aufeinander folgende Tage, 2) vereinfachte Ansätze zur Trennung Fluorophore mit überlappenden Anregungs-/ Emissions-Profile (zB GFP und YFP), 3) Verwendung von hypopigmentierte Mutantenlinien zu erweitern das Zeitfenster für hochauflösende Bildgebung in den späten Larvenstadien der Entwicklung, 4) Einsatz von Membran gezielt fluoreszierenden Reporter zu offenbaren feine morphologische Details der einzelnen Zellen sowie zelluläre Details in größeren Populationen von Zellen, und 5) eine zuvor beschriebene Verfahren zum chemisch-induzierte Ablation von transgen gezielte Zelltypen, dh Nitroreduktase (NTR) vermittelte Umwandlung von Prodrug Substrate, wie Metronidazol (MTZ), um zytotoxische Derivate ^3,5.

Als ein Beispiel dieser Ansätze werden wir visualisieren die Ablation und Regeneration ein Subtyp der Netzhaut bipolaren Neuronen innerhalb der einzelnen Fische über mehrere Tage. Gleichzeitig werden wir überwachen mehrere andere retinale Zelltypen, einschließlich benachbarten Nicht-Ziel bipolaren Zellen und potenziellen Degeneration der Netzhaut-stimulierten Stammzellen (dh Mϋller Glia). Diese Strategie wird in unserem Labor angewendet, Zell-und Gewebe-Ebene (zB Stammzellnische) Antworten auf die selektive Verlust und Regeneration von gezielten neuronalen Zelltypen zu charakterisieren.

Protocol

1. Transgene und Mutant Linien

1. Gründung / Erwerb von transgenen Zebrafisch Linien, die Zelltypen des Interesses differentiell mit fluoreszierenden Reporter-Varianten bezeichnet haben. Optimal ist die Anregung / Emission Profil des ausgewählten Reportern minimale Überlappung (zB ECFP und EYFP) haben sollte, dies ist jedoch nicht zwingend erforderlich. Für unsere Zwecke, gefesselte die Verwendung von Membran-Fluoreszenz-Reporter erleichtert Bildgebung feinzellige Details, wie neuritischen Prozesse, um einzelne Zelle Zahlen und / oder Morphologien in großen comingled Gruppen zu lösen und zu "Highlight" Regionen mit hoher Membran Inhalte, z. B. synaptischen Neuropile.
2. Für die Bildgebung am späten Larvenstadien, ist es hilfreich, ableiten / cross transgenen Linien in mutierte Hintergründe, die Pigmentierung zu reduzieren [eg, Roy Orbison (roy) oder Roy Orbison, Albino (roy; alb); ^4]. In unserer Erfahrung, Reduzierung der iridiphores (zB roy) die wichtigste Frage ist, kann Melanogenese angesprochen chemisch unter Verwendung von 1-Phenyl-2-Thioharnstoff (PTU) oder mit "Albino"-Mutanten, die Melanophoren fehlen werden. Beachten Sie jedoch, dass Ren et al. ^4, haben visuelle Defizite und bescheidenen morphologischen Veränderungen in Netzhaut der Fische fehlen melanaphores gezeigt, und das intensive Licht kann Photorezeptor Tod in "Albino"-Mutanten zu induzieren. So müssen diese Fragen berücksichtigt werden bei der Gestaltung Imaging Experimente und / oder der Interpretation der Daten.
3. Für diese Demonstration wurden die transgenen und mutierte Fische Linien verwendet:
   1. Tg (nyx: Gal4-VP16) ^{q16a / +;} Tg (UAS: gap43-YFP) ^{q16b / +;} Tg (UAS-E1b: NfsB-mCherry) ^{C264 / +;} Tg (PAX6-DF4: gap43-CFP) ^{Q01 / +;} roy ^a9/a9
   3. Hinweis: Bei Fischen "1", eine Subpopulation von nyx-Promotor definiert Netzhaut bipolaren Zellen exprimieren eine Membran-tagged YFP und / oder eine NTR-mCherry Fusion Reporter (die meisten äußern beide), und fast alle Retina-Zellen exprimieren eine Membran-markierten GFP . Fish "2" sind, wie oben, außer Müller Gliazellen cytosolische GFP auszudrücken und globale retinale GFP Expression wurde beseitigt. Expression der NTR-mCherry Fusion macht nyx definierten bipolaren Zellen anfällig für Prodrug-induzierte Ablation ^3,5.

2. Auswahl und Vorbereitung der Embryonen / Larven für Live Imaging

1. Mate-transgenen / mutanten Linien von Interesse, sammle Eier und bebrüten / bei 28,5 ° C zu halten in 0.3x Danieau-Lösung (oder "Embryo Medium" der Wahl).
2. Wenn nicht in einem "Albino" Hintergrund sollten PTU hinzugefügt Tyrosinaseaktivität vor keine Anzeichen von Pigmentierung im Gewebe von Interesse (zB ~ 16 hpf für das Auge, 200 uM final) zu hemmen. Beachten Sie, dass die Behandlung mit PTU bei Konzentrationen von mehr als 75 uM kann die Toxizität und / oder teratogene Effekte verursachen. Doch weil das Auge ist stark pigmentiert werden Behandlungen unter 200 uM nicht für hochauflösende konfokale Bildgebung ausreichend; unter diesen Bedingungen ist es wichtig, gesund aussehende Fische für die Bildgebung zu wählen. Für die Bildgebung in anderen Geweben kann 75 uM PTU vorzuziehen. Auch, wie oben erwähnt, von "Albino" Mutantenlinien Nutzung entfällt die Notwendigkeit, Embryonen mit PTU behandelt und ist eine bevorzugte Strategie für die Bildgebung am späten Larvenstadien.
3. Sobald fluoreszierenden Reporter sind evident, sortieren Fisch nach Ausdruck und der allgemeine Gesundheitszustand mit einem Fluoreszenz-Stereo-Zoom-Mikroskop oder ähnliche Transgens.
4. Vor dem ersten Tag der Bildgebung, lösen sich niedrig schmelzende Agarose (LMA) in Embryo-Medium bis zu einer Endkonzentration von 0,5%, Wärme und mischen in Lösung, lagern bei 40 ° C zu halten
5. Am ersten Tag der Bildgebung, bereiten Montage Lösung: Fügen Sie Tricaine (ein Betäubungsmittel, 756 uM final) und PTU (falls erforderlich) auf 0,5% LMA in Embryo Medium, vorsichtig mischen, und zurück auf 40 ° C.
6. Anesthetize Fisch durch die Übertragung in Embryo-Medium mit PTU und / oder Tricaine, genügend Zeit für Fische nicht mehr reagiert auf Berührung (~ 3 min).
7. Transfer einzelnen Fische in Montage-Lösung, dabei nicht um die Agarose zu verdünnen, so dass sie wiederverwendet werden kann. Wir verwenden eine Mikropipette mit getrimmten Tipp für die Übertragung, das hilft auch, eine kontrollierte Menge (~ 30 ul) zu halten. Nach dem Erwerb, Invertzucker Pipette und lassen Sie Fisch auf dem Boden absetzen, so dass das Berühren der Spitze bis zur Montage-Lösung ermöglicht die Schwerkraft übertragen, ohne dass irgendeine Flüssigkeit zu zerstreuen.
8. Nach dem Transfer zu vertreiben Anästhesielösung aus Mikropipette und es verwenden, um die Fische in einem ~ 30 ul Tropfen Montage Lösung in eine Petrischale übertragen.
   Hinweis: Diese Montageart ist nur für aufrechte Mikroskopie, wo lange Arbeitsabstand Wasserimmersionsobjektive verwendet werden relevant. Für michthoden relevant inverse Mikroskope, wo Deckgläser sind erforderlich, siehe Andersen et al, 2010;. O'Brien et al, 2009;. Graeden und Sive 2009.
9. Einbau im Rücklauf Lösung auf 40 ° C Heizblock.
10. Mit der Wimper zu Pinsel oder ähnlichem vorsichtig drehen Fisch in die gewünschte Position und Orientierung der Region von Interesse in der Mitte der Agarose Tropfen.
11. Wiederholen Sie die Schritte 6 bis 10, um die gewünschte Anzahl der Embryonen pro Schale zu montieren. Für die serielle Zeitraffer-Experimente (siehe unten) haben wir in der Regel montieren sechs Fische in einer Zeit und versuchen, Imaging-Sitzungen zu 1 Stunde pro Gruppe zu begrenzen.
12. Während der Montage andere Fische wieder überprüfen, ob bisherige Themen unterhalten gewünschte Ausrichtung bis Agarose erstarrt (~ 3 min).
13. Nach Agarose erstarrt ist, die Beförderung von Fisch zu konfokalen Mikroskops und sanft hinzu Embryo-Medium mit PTU und / oder Tricaine, die Schüssel, bis alle Fische sind komplett überflutet.

3. "Multicolor" in vivo konfokale Imaging

Hinweis: Wir haben versucht, das Protokoll unter, so dass es relevante Informationen für andere Mikroskop-Konfigurationen bietet verallgemeinern. Spezielle Hinweise auf Olympus und ImageJ Software-Anwendungen sind in Anführungszeichen. Unsere Imaging-System ist eine Olympus FV1000 aufrecht konfokalen Mikroskop mit 405 ausgestattet, 440, 488, 515, 559 und 635 nm Laser, zwei variable Sperrfilter Detektionskanäle (erlaubt Emissionswellenlänge Einstellungen in Schritten von 1 nm eingestellt werden), eine Standard-Barriere Filter-Kanal (für Rot-und Fern-Rot-Bildgebung), und eine Durchlicht-Kanal.

1. Öffnen Sie die Imaging-Software ("FV10-ASW") und verwenden Sie entweder übertragen oder fluoreszierenden Lichtquellen in der Region von Interesse zu finden. Für eine optimale Bildgebung von Zell-und / oder molekularen Detail verwenden lange Arbeitsabstand Ziele mit hoher NA (zB 60X, 1.2NA).
2. Wenn das Sammeln Durchlichtbilder, Schwerpunkt der Feldblende für Köhler-Beleuchtung.
3. Wählen Sie das entsprechende fluorphores aus dem "Dye List" oder laden Sie Aufnahme-Parameter aus einer zuvor gespeicherten Bilddatei. Anpassungen vornehmen, um Emissionsbereiche ("Spectral Setting"), die für eine saubere Trennung von Reporter-Signale und / oder maximalen Signal-Rausch-Verhältnis. Diese Einstellungen müssen empirisch für jedes Experiment, das Übersprechen zu minimieren, sondern maximieren Signal definiert werden; Einstellungen für die Beispiele hier sind nachfolgend dargestellt:

   Flourphores	Lasers (nm)	Barrier Einstellungen / Emission Filter (nm)
   1) ECFP, EYFP, mCherry *	440, 515, 559 *	460-500, 530-545, 575-675
   2) EGFP **, EYFP **, mCherry	488, 515, 559	500-515, 530-545, 575-675

   
   * Imaging von mCherry könnte verbessert mit einer höheren Wellenlänge Laser (z. B. 568 oder 594 nm) werden
   ** Eine sequentielle Imaging-Modus ermöglicht dichroitischen Spiegel und Sperrfilter Veränderungen ("Virtual Channels") ist erforderlich aufgrund der Emission / Anregung Überschneidungen zwischen GFP und YFP. GFP und mCherry kann zu einem Kanal, YFP in einen separaten Kanal zugeordnet werden. Hinweis: Übersprechen zwischen GFP und YFP Bilder werden offensichtlich vor Bildsubtraktion (Teil 6).
4. Stellen Sie sicher, das Ziel verwendet in dem Dropdown-Menü ausgewählt wird keine Software definierte Presets richtig eingestellt sind zu gewährleisten.
5. Um den Fokus Laser und setzen Leistungsstufen, wählen Sie eine Nachschlagetabelle (LUT), die Pixel-Sättigung zeigt ("Hallo-lo") für jeden Kanal. Set-Detektor-Empfindlichkeit ("HV", PMT-Spannung) auf einen Wert in Übereinstimmung mit gewünschten Bildqualität (definiert empirisch) und dann langsam gesteigert Laserleistung bis Bildintensität ist akzeptabel vermeiden Pixel Sättigung.
6. Prüfen Sie, ob Übersprechen zwischen den Kanälen, sicherzustellen, dass jeder Laserlinie nachweisbares Signal erzeugt nur in den entsprechenden Kanal durch manuelles Drehen Laser ein-und ausschalten, während die Überwachung aller abbildenden Kanälen. Zur Vermeidung von Übersprechen zu reduzieren Laserleistung. Wenn kein Übersprechen ist evident, können alle Kanäle gleichzeitig erfassen bietet erhebliche Zeitersparnisse werden.
7. Im Falle von unvermeidbaren Übersprechen, verwenden Sie einen "Sequential" Imaging-Modus, der zwischen Laser / Kanäle schaltet individuell. Extreme Fälle (z. B. bildgebende GFP und YFP) erfordern den Einsatz von sequentiellen Modi, die auch Schalter dichroitische Spiegel und / oder Sperrfilter ("Virtual Channels"). Hinweis: Diese Option stellt erhebliche zeitliche Verzögerungen in der Bildaufnahme und dürfen nicht ap werdenpropriate zur Erfassung hochdynamischer Vorgänge.
8. "Zoom" und "Rotation"-Funktionen können verwendet werden, um weitere Frame den Bereich von Interesse sein. Zoom auch verwendet werden, um die Bildauflösung zu verbessern, bis an die Grenzen der objektiven und Scan-Format verwendet werden (zB 512 x 512, für Informationen zu diesen Problemen zu sehen, http://corefacilities.systemsbiology.net/imaging/documents/app_note_image_res . pdf).
9. Für in-vivo-Bildgebung im Allgemeinen und von besonderer Bedeutung für Zeitraffer-Imaging, müssen Techniken, die Phototoxizität Fragen (dh Anhäufung von freien Radikalen) zu minimieren, um zu betonen, schnelle Scan-Geschwindigkeiten (zB 2 ms / Pixel) und niedriger Laserleistung Ebenen (z. B. 1%) sollte wo immer möglich sein, ebenso wie der niedrigsten Auflösung Scan-Format ausreichend für die Erfassung von markanten Informationen.
10. Zur Verbesserung der Bildauflösung, Scan-Mittelung ("Kalman") können während der Akquisition genutzt werden. Langsamer Scan-Geschwindigkeiten verbessern auch Auflösung, sondern erhöhen Laser Verweilzeit, die Phototoxizität und Ausbleichen Probleme verschärfen wird. Beachten Sie, dass diese beiden Ansätze nicht ideal für Time-Lapse aufgrund Potenzial für Unfähigkeit zu raschen Veränderungen über einen z-Serie, ein Phänomen nennen wir "Zeit Unschärfe" zu erfassen. Beachten Sie, dass im Durchschnitt durch die Linie im Vergleich mit Rahmen kann helfen, "Zeit Unschärfe" Fragen in einer Ebene, aber nicht in z-Tiefe zu beseitigen.
11. Wenn Signalintensitäten sind niedrig und die maximale Bildauflösung ist nicht erforderlich (z. B. einfaches Abzählen Zellzahlen), die Erhöhung der konfokalen Blende (Pinhole Durchmesser) können verwendet werden, um Signal zu verstärken werden. Dies dient zu halten Laserintensitäten niedrig, wodurch Phototoxizität und Bleichen, aber beim Einstellen der Blende auf einen Wert größer als 1 Airy Einheit führt zu einer schnellen Verluste in der Bildqualität.
12. Definieren Sie z-Tiefe Abmessungen mit einem schnellen Scan-Modus ("Focus x4"). Da Signalintensität nimmt im allgemeinen mit z-Tiefe ist es am besten, um Z-Stapel-Übernahmen auf der untersten Tiefe und enden am meisten oberflächlichen starten, ermöglicht dies schwieriger Signale zu erwerben, bevor signifikante Bleichen auftritt.
13. Überprüfen Sie für eine ausreichende Signalerkennung in die Tiefe des Bildes. Wenn gewünscht, kann eine z-Dimension Helligkeitskorrektur-Funktion ("Bright Z") verwendet, um Bildaufnahmeparameter in bestimmten Tiefen anzupassen.
14. Stellen Sie die z-Dimension Schrittweite nach experimentellen Anforderungen. Zum Beispiel in unserem ersten Beispiel (Abbildung 1) waren wir einfach unter eine "Zelle Volkszählung" in den einzelnen Netzhaut über mehrere aufeinander folgende Tage, damit wir die z-Tiefe auf 15 Mikrometer und nahm fünf Minuten vor sieben Bilder pro Netzhaut. Diese Strategie erlaubt es uns, jede Netzhaut ohne zelluläre Überlappung zwischen den Bildern Probe. In unserem zweiten Beispiel (Abbildung 2), führten wir eine schnelle 4D Zeitraffer-Filme, in denen GFP und mCherry Signale notwendig, um räumlich korreliert werden, so setzen wir die Schrittweite bis dreimal die theoretische laterale Auflösung eines Kompromisses, Z-Stapel-Bildern erlaubt ergriffen werden alle 5-10 Minuten, aber immer noch serviert, einzelne zelluläre Detail zu lösen.
15. Erwerben Sie Bilder ("XYLZt") und zu speichern. Fahren Sie mit dem nächsten Fisch, wenn die Durchführung einer seriellen Zeitraffer-Experiment (siehe Nr. 4 unten). Für eine schnelle Time-Lapse Imaging siehe Nr. 5 unten.

4. Serial 'Catch and Release "Imaging: ein Verfahren zur Verfolgung zellulärer Änderungen in einzelnen Fische über mehrere aufeinander folgende Tage

1. A 'catch and release "-Protokoll wird verwendet, um die Zeit, Fische zu minimieren immobilisiert werden und die Zahl der Fische pro Experiment abgebildet erhöhen. Der Nutzen dieser Technik ist es, biologische Prozesse, die über mehrere Tage zu entfalten (zB Mumm et al. 2006 ²⁾ begrenzt. Ein Vorteil dieses Ansatzes ist, dass alle beobachteten Veränderungen werden intern geregelt ermöglicht, dh Vergleiche zwischen verschiedenen Zuständen des Einzelnen statt auf Populationen. So präsentieren Nachverfolgen von Änderungen in der Anzahl der markierten Zellen in einem bestimmten Gewebe kann genau durchgeführt werden, auch wenn die Anzahl der Zellen zunächst gekennzeichnet variiert stark zwischen den einzelnen Fisch. Methoden für die Verwendung dieses Protokolls im Rahmen eines Pro-Pharmakon-induzierte Zellablation Assay ^3,5 finden Sie hier.
2. Zur Visualisierung der Ablation und der Regeneration von gezielten Zelltypen in den einzelnen Fisch im Laufe der Zeit sind konfokale Bilder vor dem Prodrug Verwaltung (Vorbehandlung) erworben, unmittelbar nach Prodrug Entfernung (Post-Behandlung) und während der Erholungsphase (Recovery Bilder).
3. Vorbehandlung Bildgebung: Fische sind montiert und abgebildet wie oben. Sobald Fische wurden abgebildet sie in Embryo Medium freigesetzt (+ Prodrug) resuspendiert und bei 28,5 ° C, bis die Post-Behandlung Imaging-Sitzung. Arbeiten in Teams von zwei, eins Montage und Loslassen Fisch, ist der andere bildgebende ein guter Weg, um die Anzahl der Fische, die pro Tag abgebildet werden können, zu maximieren.
4. Nach der Bebilderung aller Fische in einer einzigen Antenne ersetzen den Embryo-Medium mit Tricaine mit Embryo Medium allein (+ / - PTU).
5. Zum Lösen Fisch, verwenden Sie Juweliere Pinzette durch Agarose auf beiden Seiten der Larven geschnitten und dann sanft zu necken Agarose weg bis der Fisch schwimmt frei im Embryo Medium.
6. Prodrug-induzierte Ablation: Transfer Larven in eine individuelle Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit Embryo Medium (+ / - PTU) + Prodrug (z. B. 10 mM Metronidazol, MTZ). Um eine genaue endgültige Prodrug Konzentrationen sicherzustellen, dass wir in der Regel aliquoten ein definiertes Volumen des Embryos Medium (+ / - PTU) mit einem 2X Konzentration von Prodrug (z. B. 20 mM) in jedes Well. Die Fische werden dann in die Vertiefungen in einem gleichen Volumen von Embryos Medium (+ / - PTU) hinzugefügt, um die endgültige Prodrug Konzentration auf 1X bringen.
7. Inkubation bei 28,5 ° C bis Zielzelle Ablation überprüft werden kann.
   Hinweis: Prodrug Behandlungsregime erforderlich, um erfolgreiche Ablation zu erreichen variieren je nach Zelltyp gerichtet sind; Prodrug Konzentration und Behandlungsdauer müssen empirisch ermittelt werden, bewusst sein, dass hohe Konzentrationen allgemeinen Toxizität, z. B.> 10 mM MTZ verursachen. Darüber hinaus können perdurance fragmentierter Reporter Signale erschweren Einschätzungen der Ablation erfolgreich, in einigen Fällen der konfokalen Mikroskopie benötigt für eine angemessene Visualisierung Zellverlust ist.
8. Post-Behandlung Bildgebung: Fische sind so montiert, dass das gleiche Gewebe optimal ausgerichtet und abgebildet wie oben. Wenn alle Fische auf einer gegebenen Platte haben abgebildet worden sind in Embryo-Medium (+ / - PTU) veröffentlicht in einzelne Wells (wie oben) resuspendiert und bei 28,5 ° C, um die Regeneration des abgetragenen Zelltyp erlauben.
9. Je nach Alter der Fische und die Zeit für die Wiederherstellung erforderlich kann es erforderlich sein, um Fisch in dieser Phase des Tests zu ernähren. Wir verwenden Lebendfutter wie Pantoffeltierchen oder Rädertierchen, um eine optimale Überleben zu sichern. Es ist auch ratsam, frisches Medium täglich stellen, insbesondere dann, wenn Fische in geringen Mengen (z. B. 96-Well-Platten) werden beibehalten.
10. Recovery-Bildgebung: Um die Kinetik der Zellersatz Dokument, können die Fische täglich während der Erholungsphase abgebildet werden. Sobald die Kinetik festgelegt wurden dem Test kann durch den Erwerb von Recovery-Bilder nur zu den Zeitpunkten von Interesse (zB vollständiger Genesung) vereinfacht werden. Abbildung 1 zeigt ein Beispiel für diesen Ansatz aus unseren Studien der retinalen Zellregeneration.
11. Am Ende des Experiments Fische sollten durch Eintauchen in 20X Tricaine (15,3 M)-Lösung auf Eis eingeschläfert werden.

5. Schnelle Zeitraffer-Imaging.

1. Für eine schnelle Time-Lapse-Tomographie (dh 'movies') von mehreren fluorphores, sind Techniken, die Phototoxizität Probleme zu minimieren kritisch (siehe oben). Wie bereits erwähnt, ist diese Technik am besten zu fluorphores eine gleichzeitige geeignet, statt sequentiell, Bildgebung
2. Pflegen Sie Fisch bei 28,5 ° C mit einem beheizten Bühne, ITO-Glas-Heizelement, oder ähnliches.
3. Verwenden Sie Methoden, die Verdunstung zu reduzieren, um zur Stabilisierung Temperatur und Osmolarität (zB O-Ring abgedichtet Deckgläser für inverse Mikroskope).
4. Bei der Verwendung von automatisierten Erfassung über längere Zeit sicher sein, die Stack-Größe einstellen, dass Wachstum und / oder Drift in der z-Dimension zu ermöglichen.
5. Set Zeitintervalle und die Anzahl der Scans ("TimeScan" oder "TimeController"). Acquisition Preise müssen empirisch entsprechend der Dynamik des biologischen Prozesses abgebildet und / oder eingestellt nach der phototoxischen Empfindlichkeit Eigenschaften der Zellpopulation etabliert werden.
6. Erwerben Sie Bilder ("XYLZt"-Taste) und speichern.
7. Zur Konstruktion 'movies' werden Bereiche von Interesse zu definieren und in der x, y, und z-Dimensionen ausgerichtet werden. Der gesamte Prozess wird über den Rahmen dieses Protokolls zu prüfen, sondern mehrere Software-Programme zur Verfügung, die auch zu erleichtern Zoom, Rotation und Panning-Funktionen während der 4D Bildmontage (Volocity, Amira, etc.).

6. Spectral Separation Bildverarbeitung mit ImageJ Freeware

1. Optimal, wenn sie eine multi-Reporter Imaging Experiment ist es am besten fluorphores, die gut voneinander getrennt sind spektral verwenden. Dies ist jedoch nicht immer praktisch und / oder möglich ist. Hier bieten wir eine vereinfachte Methode zur Trennung von fluorphores, dass sich überlappende Anregungs-und Emissions-Profilen haben, in diesem Fall GFP und YFP. In dem Beispiel zur Verfügung gestellt, wir haben die Zeit genutzt, Zeitraffer bildgebenden Verfahren beschrieben, um das Verhalten von GFP-markierten retinalen "Stammzellen", Müller Glia Stück, während die gezielte Ablation und die Regeneration der Netzhaut bipolaren Zellen mit YFP und NTR-mCherry beschriftet (Abbildung 2).
2. Sammeln von Bildern mit sequentieller Bildgebungsmodi und variable Sperrfilter, dass sich überlappende Fluorophore unabhängig erworben werden und teilweise getrennt sind (siehe oben für GFP / YFP-Einstellungen Beispiel) ermöglicht. Zum Entfernen Übersprechen verwenden wir ein einfaches Bild Subtraktion Strategie, die man Kanäle Signal von einem anderen entfernt.
3. Bildsubtraktion Prozess: Install die neueste Version von ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/notes.html), Loci Bio-Formate Werkzeug (http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej) , und richten Sie Stapel-Plug-in (http://www.med.harvard.edu/JPNM/ij/plugins/Align3TP.html).
4. Verwenden Sie die Loci Bio-Formate Import-Plug-in für Bild-Dateien zu öffnen, einfach indem Sie die Datei von Interesse auf die ImageJ-Fenster wird das Import-Tool zu starten. Split, die Kanäle in einzelne Stapel mit der "Split-Kanäle" Checkbox in das Import-Fenster oder das "Split-Kanäle" unter "Channel Tools" (Umschalt + Strg + z) nach dem Laden.
5. Starten Sie den Align 3 TP-Plugin (Plugins> Align-Stacks> Align 3 TP). Die Stapel müssen ausgerichtet, um eine ordnungsgemäße Subtraktion zu gewährleisten. Wählen Sie die Referenz-Stack in der ersten Dropdown-Box und die falsch ausgerichtet Stapel in der zweiten. Überprüfen Sie die "Verwendung xy relativen Herkunft" und "use z relativen origin"-Boxen und klicken Sie auf "OK".
6. So starten Sie den Alignment-Prozess, auf den "Volume Registration"-Taste. Ein neues Fenster wird erscheinen, das enthält die Ausrichtung Parameter. In diesem Abschnitt wird durch den Verteiler des Plugins ist optimiert worden, keine Änderungen notwendig sind, klicken Sie einfach auf "OK".
7. Wenn Sie fertig sind, wird eine "Aligned Stacks"-Fenster angezeigt. Wählen Sie "Output" von der Align-Fenster und das Fenster Ausgabe erscheinen soll. Dieses Fenster wird ebenfalls optimiert und benötigt keine Änderung. Klicken Sie auf "OK". Ein neuer Stapel sollte in den Arbeitsbereich mit "Aligned" an das Ende der Datei Titel erscheinen.
8. Crosstalk wird entfernt mit dem "Image Calculator" (Process> image Calculator) sein. Wählen Sie den Stapel in der Image1 Dropdown-Box und der Stapel in der Subtraktion in der Image2 Dropdown-Box verwendet abgezogen werden. Wählen Sie "Subtrahieren" in der Bedienung Dropdown-Box ein und klicken Sie "OK". ImageJ wird Sie fragen, um die Stapel zu verarbeiten, wählen Sie "Ja". A new stack erscheinen soll, die hat das Übersprechen zwischen überlappenden Kanälen entfernt.
9. Um das gleiche Bild Struktur erstellen, bevor Ausrichtung und Subtraktion Stacks, die zusammengeführt werden müssen. Wählen Sie "Kanäle zusammenfügen" in den Channel Tools-Fenster. Das Tool ermöglicht es Ihnen, verschmelzen bis zu vier Stapel in eine HyperStack.
   Hinweis: Um mehr als 4 Stacks, verketten Stacks in der gewünschten Reihenfolge mit den verketten Werkzeug (Bilder> Stacks> Werkzeuge> verketten) zu fusionieren. Konvertieren Sie die verkettete Stack zu einem HyperStack (Bilder> HyperStack> Stack HyperStack). Verkettung der Stapel verändert die Tiefe, Zeit, Kanal (ZCT) bestellen, das muss zurückgesetzt werden im Dropdown-Box, die erscheint, set ", um" xyztc, stellen Sie "Kanäle", "Slices" und "Frames" nach dem Anzahl der Stacks, Tiefe des Stapels, und die Anzahl der Zeitpunkte, bzw. ..
10. Schließlich müssen alle Kanäle, um kolorierte, angepasst für Helligkeit und Kontrast, und gespeichert als TIFF-Dateien. Von hier aus ist die Umstellung auf RGB, Montage, z-Projektion, oder Zeitreihen das gleiche Verfahren wie für die Original-Dateien.

7. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1. Ein Zeitraffer-Serie von konfokalen Bildern demonstriert gezielte Verlust und Regeneration der NTR-mCherry Ausdruck Netzhaut bipolaren Zellen (rote Blutkörperchen). A & A ') Vor der Behandlung gibt es Mosaik Ausdruck von Membran-tagged YFP-Reporter in "control" bipolare Zellen, in gelb dargestellt, und Nitroreduktase-Cherry-Fusionsprotein in "gezielte" Bipolar-Transistoren in rot dargestellt. B & B ') Nach der Behandlung mit Metronidazol, die rote Nitroreduktase-exprimierenden bipolaren Zellen sind verloren, während die gelben "control" bipolare Zellen, geschont werden. Dies zeigt der besonderen Natur dieser Ablation Methodik. C & C ') Bei Metronidazol entfernt wird, NTR-Expression (rot) Zellen zurückzukehren.

Abbildung 2. Enthält ein Beispiel für die Bildsubtraktion Prozess, der GFP und YFP zu sauber getrennt werden folgende Akquisition ermöglicht. A & A ') Vor Abzug der GFP (grün) und YFP (pseudocolored lila) Bilder ausgerichtet sind. B & B ') Die Subtraktion Prozess ermöglicht YFP-markierten bipolaren Zellen aus der GFP-Bild entfernt werden, so dass GFP-markierten Müller Glia leichter erkannt werden. C & C ') Co-Expression von GFP (grün) und mCherry (rot) zeigt sich in der Zelle durch den Pfeil. Da Co-Expression der Müller Gliazellen Marker und bipolare Zell-Marker legt nahe, dass bipolare Zellablation löst Müller Glia, um die verlorenen Zellen zu ersetzen. Diese Interpretation steht im Einklang mit neueren Untersuchungen der Netzhaut Regeneration, die Müller Gliazellen als Verletzung induzierten "Stammzellen" in beiden Säugetieren und Fischen zu verwickeln.

Discussion

In diesem Video wird ein Überblick über die Techniken, die wir für multicolor konfokalen Zeitraffer-Imaging-und Zielzelle Ablation zur Verfügung gestellt. Wir beschäftigen Zeitraffer-Imaging um das Verhalten der verschiedenen Zelltypen des Interesses in vivo beobachten, während Zielzelle Ablation wird verwendet, um neuronale Schaltkreis Funktion und Zell-spezifische neuronale Regeneration Paradigmen zu studieren. Die gezeigten Beispiele hervorheben mehrere Vorteile, die sich aus diesen Ansätzen entnommen werden kann. Vielleicht am wichtigsten ist, bietet Zeitraffer-Bildgebung eine intern gesteuert Paradigma; sämtliche Phänomene beobachtet werden können zurück zur vorherigen Zustände bezogen werden. Dies ermöglicht den direkten anstatt abgeleitet Vergleiche zwischen experimentellen Zeitpunkten vorgenommen werden, so dass relative Veränderungen leichter zu quantifizieren und zu reduzieren experimentellen "Rauschen" mit Variationen innerhalb einer Population assoziiert. Ein Vorteil der multicolor Bildgebung ist die Fähigkeit, Veränderungen im Umgang und / oder benachbarten Zelltypen zu visualisieren. Zum Beispiel mit Hilfe einer transgenen Linie, die Müller Glia-Etiketten, sind wir nun die Charakterisierung der Reaktion dieser möglichen Verletzung induzierten Stammzellen, um den Verlust von diskreten retinalen Zell-Subpopulationen. Wir haben auch diesen Ansatz verwendet, um neuartige Mechanismen der neuronalen Schaltkreis Bildung ^{2 zu} definieren. Schließlich wird neben dem Studium der Zellregeneration, haben wir vor kurzem begonnen mit der NTR-basierte Ablation System der funktionalen Rolle neuronaler Subtypen damit diskrete neuronale Schaltungen mit verschiedenen Verhaltens-Paradigmen und elektrophysiologische Tests zu untersuchen. Der einzigartige Vorteil der Verwendung der Zebrafisch für solche Untersuchungen ist, dass aufgrund ihrer Regenerationsfähigkeit, induzierte Defizite vorübergehend sind. So kann durch die Korrelation mit Zeitraffer-Imaging-Assays können wir verkörpern Reinnervation Mechanismen, die zu führen, sowie das Ausmaß der Reinnervation für, funktionelle Wiederherstellung erforderlich sind.

Die Methoden bereitgestellt werden, um viele verschiedene Fragestellungen angepasst werden. So können ähnliche Analysen der Ablation und Regeneration keine transgen definierbare zellulären Subtyp angewendet werden. Gemeinsam haben solche Studien Potenzial für unser Verständnis der Wiedergeburt auf der Ebene der einzelnen Zelltypen und in diskreter Stammzellnischen erweitern.

Materials

1. Reagents:

Danieau's solution:

sodium chloride (Fisher, S271 1) potassium chloride (Fisher, P217 500) HEPES (Fisher, BP310500) magnesium sulfate (Fisher, M65 500) calcium nitrate (Fisher, C109500) Penicillin-Streptomycin (Fisher, ICN1670049)

Other reagents:

Low melt agarose (Fisher, BP165-25) Tricane methanesulfonate (Fisher, NC9435281) N-phenylthiourea (Fisher, NC9968868) Metronidazole (Fisher, AC21034-1000)

2. Supplies:

Deep petri-dishes (Fisher Scientific/Corning, 08-772-32) Dumont #5 fine forceps (Fisher, NC9404145)

3. Equipment:

Zoom Stereoscope (Olympus, SZ51) Fluorescence Zoom Stereoscope (Olympus, SZX16) Confocal microscope (Olympus FV1000) Digital block heater - Isotemp (Fisher, 11-715-125DQ) Barnstead/Thermolyne Benchtop Incubator (Fisher, 11-702-4).