利用含有包埋细胞且表面涂覆内皮细胞的圆柱形胶原凝胶（称为模块）来构建微组织。
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摘要
摘要
本方案描述了一种称为模块的微组织的制备方法。模块化方法可生成均一、可扩展且具有血管化的组织。模块可由胶原蛋白以及其他可凝胶化或可交联材料制成。制备完成时模块长约2 mm，直径约0.7 mm，但在包埋细胞后或经内皮细胞包被后会收缩。单个模块体积足够小，使包埋细胞处于氧气及其他营养物质的扩散极限范围内；但多个模块可堆叠组装形成更大的可灌注组织。由于可在模块中包埋或在其表面包被不同类型的细胞，再将其组装成复杂组织，因此该组织具有模块化结构。模块制备主要包括三个步骤：（1）中和胶原蛋白并将其与细胞混合；（2）在管中使胶原蛋白凝胶化并切割成模块；（3）用内皮细胞包被模块。
方案
1）导管的制备
- 剪取 2 至 3 米长的聚乙烯管（内径 0.76 mm × 外径 1.22 mm）。
- 将一根 20 G1 针头穿入管的一端。
- 将管盘绕成线圈状，放入自封式灭菌袋（7 1/2" × 13"）。管的两端应置于袋的未封口端，并用气体灭菌胶带固定。
- 密封袋子并进行气体灭菌。
2) 胶原蛋白的中和
注意：1 ml 胶原蛋白可填充约 2 m 的聚乙烯管。
- 将所需量的胶原蛋白放入15 ml锥形管中，置于冰上保存，以用于制备所需长度的管状结构。
- 每毫升胶原蛋白中加入128 μL的10倍浓度α-MEM，并通过反复移液混合溶液。注意：（1）当α-MEM与酸化胶原蛋白混合后，溶液应变为黄色；（2）混合时应尽量减少气泡产生。
- 加入0.8 M碳酸氢钠中和胶原蛋白，直至胶原蛋白pH达到7.4。作为pH值的粗略判断标准，当黄色胶原蛋白溶液变为浅粉色时即为中和完成。注意：通常每毫升胶原蛋白需要30至60 μL碳酸氢钠。
- 中和后的胶原蛋白在使用前应始终置于冰上，因为若不在4°C条件下保存，中和后的胶原蛋白会发生凝胶化。
3）细胞包埋（可选）
注意：根据细胞类型的不同，可将细胞以每毫升100万至2000万个细胞的浓度包埋。请使用适合您要包埋细胞类型的培养基。
- 吸去细胞培养液，加入 5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。
- 吸去 PBS，加入 3 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液。
- 将细胞在 37°C 下用胰蛋白酶-EDTA 溶液孵育 5 分钟。
- 用 7 mL 培养液重悬细胞。
- 进行细胞计数。
- 将所需数量的细胞转移至 15 mL 圆锥形离心管中用于包埋。
- 在 300 × g 条件下离心 5 分钟，使细胞沉淀。
- 吸去细胞沉淀上方的培养液。
- 用中和的胶原溶液重悬细胞，并置于冰上保存。
4）胶原蛋白凝胶化
- 在生物安全柜中，剪开装有聚乙烯管的袋子的密封端。
- 使用无菌镊子将3 ml注射器连接到聚乙烯管一端的20G针头上。保持聚乙烯管置于袋内。
- 使用无菌镊子将聚乙烯管的另一端插入中和后的胶原液中，直至管尖到达锥形管底部。保持锥形管置于冰上。
- 缓慢回抽注射器活塞，将胶原液吸入聚乙烯管中。
注意：若胶原液被过快吸入管中，则会在胶原内形成气泡。 - 将胶原液吸入管后，拔出20G针头，并将两端重新放回袋中。用胶带密封袋子。
- 将袋子在37°C孵育60分钟。若胶原中含有细胞，则每15分钟翻转袋子一次，以防止细胞沉降到模块的一侧。
5）切割含有凝胶化胶原的管路
- 对切割装置的刀头、刀片以及用于盛放管路的托盘进行高压灭菌。
- 组装切割装置。
- 将管路放置于切割装置前方的无菌托盘中，并将管路装入切割装置内。
- 在切割装置出口处放置一个50 mL锥形管，内含25 mL培养基，用于收集切割后的模块。
注意：即使为仅含胶原的模块，也应使用含有胎牛血清（FBS）的培养基，因为若培养基中不含FBS，模块无法从管路中分离。若模块中含有细胞，则使用所包埋细胞所需的培养基；若模块中无包埋细胞，则使用内皮细胞的培养基。 - 将切割装置设置为切割2 mm长度的管路，并进行切割。
- 将切割后的模块置于50 mL锥形管中，在37°C下孵育60分钟。
6) 从管路中移除胶原模块
- 将含有管道中模块的 50 mL 离心管涡旋震荡 10 秒。
注意：分离高细胞密度嵌入的模块时应轻柔操作，以避免破损。 - 让模块沉降至管底，约需 5 分钟。
- 使用宽口 10 mL 血清移液管将已沉降的模块转移至 15 mL 离心管中。
- 重复步骤 6.1 至 6.3 两次。
- 进入步骤 7 以用内皮细胞包被模块，或将模块转移至未经组织培养处理的培养板中。
7) 用内皮细胞包被模块
- 将模块放入15 mL圆底离心管底部，加入5 mL培养基以浸没细胞。
- 吸去内皮细胞的培养基，并用5 mL PBS洗涤。
- 吸去PBS，加入3 mL胰蛋白酶-EDTA溶液。
- 在37°C条件下，将细胞在胰蛋白酶-EDTA中孵育5分钟。
- 用7 mL培养基重悬细胞。
- 进行细胞计数。每毫升紧密排列的模块底部需含有5×106个内皮细胞。
- 在300 × g离心5分钟以收集细胞，并用5 mL内皮细胞培养基重悬。
- 将含有内皮细胞的5 mL培养基加入模块中。
注意：此操作可形成两种培养基各占50%的混合体系，我们发现该比例有利于两种细胞类型的存活与功能维持。若拟使用专门配制的共培养培养基，应先测试其是否可有效维持两种细胞的表型，再投入使用。 - 将模块与内皮细胞在静态和动态条件下共同孵育。
- 对于静态孵育，通过轻柔翻转混匀模块与内皮细胞，然后将离心管直立置于37°C环境中孵育15分钟，重复一次。
- 动态接种内皮细胞时，在37°C下轻轻摇动离心管60分钟。
- 重复进行两次静态孵育。
- 将模块转移至未经组织培养处理的培养板中，在37°C下孵育过夜。
- 次日，将模块转移至新的未经组织培养处理的培养板中，加入新鲜培养基（若使用共培养体系，则采用50:50混合培养基），以去除未贴附的内皮细胞。
- 继续孵育已覆盖内皮细胞的模块，直至细胞完全覆盖模块表面（覆盖率100%）。此过程通常需要约7天。
8) 代表性结果：
模块刚从试管中取出时呈圆柱形。如果模块内含有包埋的细胞和/或表面包被有内皮细胞，则其体积可收缩达50%，并形成椭圆形（图1）。在光学显微镜下观察，模块也会变得更加致密和不透明（图1）。当模块表面的内皮细胞达到融合状态时，会形成紧密连接，可通过VE-钙黏蛋白（VE-Cadherin）的免疫荧光染色观察到（图2）。传质分析表明，这些模块能够在不形成因氧气传输不足导致的坏死核心的情况下，支持高密度细胞生长（8×107 个细胞/cm3），而这一问题在较大的组织中常常存在（例如，大直径模块，D = 1.4 mm）（图3）。
图1： 模块的制备与收缩。在人脐静脉内皮细胞（HUVEC-C）接种后的三天内，模块发生收缩，其直径和长度显著减小（p < 0.001）（A）。在制备时，嵌入的HepG2细胞在模块内均匀分布，并保持高存活率（B）。[活细胞 绿色；死细胞 红色] [改编自Corstorphine 2010]
图 2： 模块表面接种RAEC并培养10天后，内皮细胞紧密连接处的VE-钙黏蛋白免疫荧光染色。比例尺 = 50 μm。
图 3： 典型模块（初始直径 0.76 mm）和大模块（初始直径 1.4 mm）的 Masson 三色染色结果展示了氧扩散限制的影响。构建七天后，大模块的核心区域（右下面板）已形成大量死细胞，仅剩一层薄薄的存活细胞边缘（约 200μm 厚）。相反，小模块则保持了均匀且高密度的活细胞分布。[模块内包埋 HepG2 细胞，并包覆内皮细胞。] [引自 Corstorphine 2010]
图4：（A）在泊洛沙胺-胶原模块上接种的HMEC-1细胞。接种后第1天，泊洛沙胺-胶原模块仍保持其圆柱形结构，与仅含胶原的模块相比，细胞附着性能有限。比例尺 = 200 μm。（B）含有基于PLGA的可生物降解微球的胶原模块的光学显微镜图像。比例尺 = 500 μm。
图5： 示例 体外 检测。(A) 血管生成检测：在与脂肪源性干细胞共培养5天后，可轻松检测并量化内皮细胞接种模块上形成的毛细血管样结构。(B) 模块上活/死细胞染色的共聚焦显微镜图像，其中活细胞染色呈绿色，死细胞染色呈红色。
图6： 含有嵌入式间充质干细胞并表面覆盖一层内皮细胞的胶原模块。该模块在微流控腔室中暴露于剪切应力（约0.64 dyn/cm2）下培养7天，开始在接触点处出现融合现象。内皮细胞经vWF染色呈棕色，间充质干细胞的细胞核呈蓝色（H&E染色）。比例尺 = 100μm。
图7： 在小鼠皮肤下植入数百个含有脂肪源性干细胞（ASC）并由人微血管内皮细胞（HMEC）包被的胶原模块，以研究ASC与HMEC之间的相互作用 体内 用于脂肪再生应用。
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讨论
我们利用嵌入不同类型细胞的模块制备了多种不同的微组织1-11我们已成功包埋了原代心肌细胞、胰岛细胞、脂肪干细胞、间充质基质细胞，以及包括HepG2、NIH 3T3和克隆9肝细胞在内的多种细胞系。我们还使用多种内皮细胞对模块进行包被，包括大鼠主动脉内皮细胞、人脐静脉内皮细胞和人微血管内皮细胞。此外，已制备出由胶原与泊洛沙胺聚合物混合物构成，或含有药物缓释微球的模块（图4）。多种 体外 已证明这些检测方法可与多种模块兼容，包括免疫荧光、蛋白质印迹、血管生成、Alamar Blue 增殖检测以及活/死细胞染色（图5）。这些模块还已被用于微流控芯片（图6），并植入小鼠和大鼠体内（图7），以研究不同类型细胞之间的相互作用，以及宿主反应对微组织的重塑过程。这些模块具有广泛的应用前景，可用于研究三维组织培养对细胞的影响、不同细胞在三维构型中的相互作用、微组织在微流控芯片中的重塑过程 体内 宿主反应对微组织的重塑。
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致谢
资金由美国国立卫生研究院（EB 001013）、加拿大自然科学与工程研究理事会及加拿大健康研究院提供。我们感谢 A. P. McGuigan 博士在模块开发过程中提供的专业知识与帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 内径管PE60 | BD Biosciences | 427416 | 可使用不同直径的导管来改变模块的直径 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | GIBCO, by Life Technologies | 20012-027 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25200-072 | |
| 酸性化胶原蛋白，3 mg/mL | Cedarlane Labs | 5005-B | |
| 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| 20G针头 | BD Biosciences | 305175 | 针头直径需与导管直径相近 |
| 3 mL注射器 | BD Biosciences | 309585 | |
| 15 mL离心管 | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 mL离心管 | BD Biosciences | 352070 | |
| Convertors 自封袋 7 1/2” x 13” | Cardinal Health | 92713 | |
| 10 ml宽口移液管 | BD Biosciences | 357504 | |
| 10 ml移液管 | BD Biosciences | 357551 | |
| 5 ml移液管 | BD Biosciences | 357543 |
参考文献
- Chamberlain, M. D., Gupta, R., Sefton, M. V. Chimeric vessel tissue engineering driven by endothelialized modules. , (2010).
- Corstorphine, L. E., Sefton, M. V. Effectiveness factor and diffusion limitations in collagen gel modules containing HepG2 cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2010).
- Gupta, R., Van Rooijen, N., Sefton, M. V. Fate of endothelialized modular constructs implanted in an omental pouch in nude rats. Tissue Eng. Part A 15, 2875-2887 (2009).
- Leung, B. M., Sefton, M. V. A modular tissue engineering construct containing smooth muscle cells and endothelial cells. Ann Biomed Eng. 35, 2039-2049 (2007).
- McGuigan, A. P., Leung, B., Sefton, M. V. Fabrication of cell-containing gel modules to assemble modular tissue-engineered constructs [corrected]. Nat Protoc. 1, 2963-2969 (2006).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Vascularized organoid engineered by modular assembly enables blood perfusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 11461-11466 (2006).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Modular tissue engineering: fabrication of a gelatin-based construct. J Tissue Eng Regen Med. 1, 136-145 (2007).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Design and fabrication of sub-mm-sized modules containing encapsulated cells for modular tissue engineering. Tissue Eng. 13, 1069-1078 (2007).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Design criteria for a modular tissue-engineered construct. Tissue Eng. 13, 1079-1089 (2007).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. The thrombogenicity of human umbilical vein endothelial cell seeded collagen modules. Biomaterials. 29, 2453-2463 (2008).
- Sosnik, A., Leung, B., McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Collagen/poloxamine hydrogels: cytocompatibility of embedded HepG2 cells and surface-attached endothelial cells. Tissue Eng. 11, 1807-1816 (2005).
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