Summary
निम्नलिखित प्रोटोकॉल फीडर मुक्त संस्कृति के लिए मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएस) की आदत डाल पूरा पीटा सीरम रिप्लेसमेंट - फीडर मुफ्त मध्यम (KSR - एफएफ) का उपयोग करने के लिए निर्देश प्रदान करता है. एक बार अनुकूलित, नित्य रखरखाव के लिए निर्देश भी प्रदान की जाती हैं.
Abstract
2006 में खोज की है कि मानव और माउस fibroblasts आईपीएस कोशिकाओं उल्लेखनीय भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के समान गुणों के साथ 1-3 उत्पन्न करने के लिए reprogrammed किया जा सकता है सेल थेरेपी, दवाओं की खोज, और बुनियादी अनुसंधान के लिए pluripotent कोशिकाओं की एक मूल्यवान नए स्रोत पैदा कर दी है.
GIBCO मीडिया और अभिकर्मकों pluripotent स्टेम सेल अनुसंधान के मामले में सबसे आगे साल के लिए किया गया है. नॉकआउट DMEM नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट के साथ पूरक पसंद के भ्रूण स्टेम सेल के विकास और अब आईपीएस कोशिका 3-9 संस्कृति के लिए मीडिया है . यह सोने के मानक मीडिया प्रणाली अब नॉकआउट एसआर ग्रोथ फैक्टर कॉकटेल के अलावा के साथ फीडर मुक्त संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
पारंपरिक मानव ES और आईपीएस सेल संस्कृति तरीके माउस या मानव fibroblast फीडर परतों का उपयोग, या फीडर वातानुकूलित माध्यम की आवश्यकता होती है. ये संस्कृति तरीकों श्रम प्रधान, पैमाने पर करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं और यह कूल्हों undifferentiated कोशिकाओं अपरिभाषित शर्तों की वजह से बनाए रखने के लिए मुश्किल है. Invitrogen नॉकआउट एसआर ग्रोथ फैक्टर कॉकटेल विकसित किया गया है आप आसानी से फीडर - मुक्त करने के लिए अपने कूल्हों सेल संस्कृतियों संक्रमण के लिए अनुमति देते हैं, जबकि अभी भी नॉकआउट एसआर के आपके उपयोग को बनाए रखने.
Protocol
नोट: बाँझ संस्कृति स्थिति बनाए रखने के लिए, इस प्रोटोकॉल में सभी प्रक्रियाओं के बाहर किया जाता है बाँझ प्रयोगशाला प्रथाओं का उपयोग और एक लामिना का प्रवाह हुड के तहत आयोजित की.
पहले शुरू, यह सुनिश्चित है कि किसी भी मीडिया 37 के लिए equilibrated है डिग्री सेल्सियस और उचित मार डाला.
Geltrex लेपित संस्कृति व्यंजन की तैयारी
नोट: CELLstart लेपित संस्कृति व्यंजन के उपयोग के लिए परिशिष्ट देखें
- पिघलना 2-8 धीरे धीरे Geltrex ° सी (1 एमएल) की एक ट्यूब और D-MEM/F-12 नॉकआउट के 99 एमएल में 1:100 पतला. धीरे समाधान मिक्स.
नोट: कुछ आईपीएस कोशिका लाइनों इष्टतम विकास के लिए एक अलग Geltrex कमजोर पड़ने की आवश्यकता हो सकती है. वैकल्पिक dilutions के लिए परिशिष्ट देखें. - Geltrex समाधान (35 मिमी के लिए एक डिश 1 एमएल, 60 मिमी के लिए एक डिश 1.5 एमएल) के साथ प्रत्येक पकवान संस्कृति की पूरी सतह को कवर.
- Parafilm साथ प्रत्येक पकवान सुखाने को रोकने के लिए और 37 पर 1 घंटे के लिए व्यंजन सेते डिग्री सेल्सियस सील
नोट: इस बिंदु पर आप 4 ° C में Geltrex लेपित संस्कृति बर्तन की दुकान करने के लिए 1 महीने के लिए लिए हो सकता है. Parafilm साथ प्रत्येक पकवान सील Geltrex बाहर सुखाने से रोकने के. - का उपयोग करने के लिए पहले, एक लामिना का प्रवाह हुड Geltrex लेपित व्यंजन हस्तांतरण और उन्हें कमरे के तापमान (लगभग 1 घंटे) को संतुलित करने के लिए अनुमति देते हैं.
पूरा पीटा SR-फीडर मुफ्त मध्यम की तैयारी
- 10 μg / एमएल मूल FGF समाधान के 1 एमएल तैयार करने के लिए, aseptically नीचे सूचीबद्ध घटकों के मिश्रण. विभाज्य समाधान और -20 डिग्री सेल्सियस पर अप करने के लिए 6 महीने के लिए दुकान.
बेसिक FGF 10 μg D-पीबीएस 990 μL 10% BSA 10 μL
नोट: BSA HSA या एक ही एकाग्रता में नॉकआउट एसआर के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है है. - 2 मिलीग्राम / एमएल Dispase समाधान के 50 एमएल तैयार करने के लिए, aseptically नीचे सूचीबद्ध घटकों के मिश्रण. बाँझ समाधान और 4 बजे दुकान ° सी अप करने के लिए 2 सप्ताह के लिए फ़िल्टर.
Dispase 100 मिलीग्राम D-पीबीएस 50 एमएल - पूरा पीटा एसआर (KSR - एफएफ) फीडर मुफ्त मध्यम aseptically नीचे तालिका में सूचीबद्ध घटकों गठबंधन की 100 एमएल तैयार करने के लिए.
आप 2-8 ° सी में KSR - एफएफ मध्यम स्टोर एक सप्ताह के लिए हो सकता है.घटक शेयर एकाग्रता अंतिम एकाग्रता आयतन DMEM/F12 नॉकआउट (Cat. नहीं. 12660-012) - 1X 76.8 एमएल GlutaMAX मैं (Cat. 35050-061 सं.) 200 मिमी 2 मिमी 1 एमएल पीटकर एसआर (Cat. नहीं. 10828-028) - 20% 20 एमएल एसआर GFC (Cat. कोई A10580-01.) पीटा 50X 1X 2 एमएल bFGF (कोई Cat.. PHG0024) 10 μg / एमएल 20 एनजी / एमएल 200 μL - बस से पहले तापमान और गैसों को पूरा मध्यम पूर्व equilibrating, aseptically 2 mercaptoethanol के लिए आवश्यक मात्रा (55 मिमी शेयर एकाग्रता) एक 0.1 मिमी अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ सकते हैं. उदाहरण के लिए, KSR - एफएफ माध्यम के 100 एमएल तैयार mercaptoethanol 2 (1:550 कमजोर पड़ने) वैकल्पिक रूप से 55 मिमी के 182 μL जोड़ने के लिए, 2 - mercaptoethanol 1X पूरा माध्यम से जोड़ा जा सकता है और 08/02 ° सी में संग्रहीत के लिए एक सप्ताह तक.
KSR - एफएफ मध्यम IPSCs अनुकूल
- पहले शुरू हुड में कमरे के तापमान पर अपने Geltrex लेपित व्यंजन पूर्व संतुलित.
- संस्कृति MEF फीडर कोशिकाओं पर IPSCs जब तक वे 70-80% मिला हुआ हैं. GIBCO MEF आधारित संस्कृति प्रोटोकॉल के लिए माउस भ्रूणीय fibroblast पुस्तिका को देखें. पूर्व एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गर्म Dispase के लिए आवश्यक मात्रा. आवश्यक मात्रा पर जानकारी के लिए नीचे एक टेबल के लिए संदर्भ लें.
- एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान for15 मिनट में KSR - एफएफ के लिए आवश्यक मात्रा पूर्व संतुलित. आवश्यक मात्रा पर जानकारी के लिए नीचे एक टेबल के लिए संदर्भ लें.
- संस्कृति बर्तन से मध्यम Aspirate, और Dispase समाधान के एक उचित मात्रा में जोड़ने के. 37 डिग्री सेल्सियस पर 3-5 मिनट के लिए व्यंजन सेते हैं.
- प्रत्येक संस्कृति पोत से Dispase समाधान Aspirate और डी पीबीएस (2 से 3 गुना) के साथ MEF फीडर कोशिकाओं धो धीरे.
- प्रत्येक संस्कृति पोत को पूरा पीटा एसआर मध्यम के एक उचित मात्रा में जोड़ें. एक सेल खुरचनी या 5 एमएल विंदुक का उपयोग करने के लिए धीरे संस्कृति पोत की सतह से कोशिकाओं परिमार्जन.
नोट: आईपीएस अनुकूलन करने के लिए मुश्किल सेल लाइनों के लिए वैकल्पिक अनुकूलन प्रोटोकॉल के लिए परिशिष्ट देखें, - प्रत्येक संस्कृति डिश से अलग 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में सेल निलंबन लीजिए. पूरा पीटा एसआर माध्यम का एक उचित मात्रा के साथ प्रत्येक संस्कृति पोत कुल्ला, और जोड़ने डी पीबीएस 15 एमएल शंक्वाकार सेल निलंबन युक्त ट्यूबों में मध्यम कुल्ला. एकल कक्षों में सेल clumps तोड़ नहीं सावधान रहो
- गोली IPSCs 5 मिनट के लिए 200 XG पर 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों अपकेंद्रित्र .
- IPSC गोली से सतह पर तैरनेवाला Aspirate. KSR - एफएफ विभाजन अनुपात (तालिका 1) के अनुसार मध्यम का एक उचित मात्रा में गोली Resuspend. एक छोटे आकार के लिए सेल clumps को तोड़ने के लिए, क्योंकि छोटे clumps अच्छी तरह से सतह को संलग्न नहीं मत करो.
नोट: हम पहले 3 मार्ग के लिए 01:02 के एक विभाजन अनुपात की सिफारिश के बाद IPSCs iPSC MEF संस्कृति मध्यम से किया गया है सीधे KSR - एफएफ मध्यम passaged. आम तौर पर, 01:03 और 01:05 के बीच एक विभाजन अनुपात उपयुक्त है, लेकिन 1:02 पर passaging कोशिकाओं की उच्च घनत्व की जरूरत है जब एक फीडर मुक्त संस्कृति में आदत डाल सुनिश्चित है. - पूर्व Geltrex लेपित व्यंजन पर IPSCs चढ़ाना, पूर्व लेपित पकवान से अवशिष्ट Geltrex समाधान aspirate, और धीरे धीरे हर संस्कृति डिश में सेल निलंबन का एक उचित मात्रा में जोड़ने. नोट: व्यंजन चढ़ाना से पहले कुल्ला नहीं करते.
- संस्कृति डिश आगे और पीछे और साइड पक्ष कई बार करने के लिए डिश की सतह भर में कोशिकाओं को फैलाने ले जाएँ. धीरे हवा में 4 से 6% सीओ 2 के एक humidified वातावरण के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में संस्कृति डिश जगह. KSR - एफएफ के साथ खर्च माध्यम हर दिन बदलें.
Passaging मानव आईपीएस कोशिकाओं KSR - एफएफ का उपयोग
- मानव पुष्टि करते हैं कि कोशिकाओं को 70-80% मिला हुआ और subcultured बनने के लिए तैयार हैं खुर्दबीन के नीचे पूरा KSR - एफएफ में बढ़ती IPSCs निरीक्षण. चित्रा 1 देखें.
नोट: यदि कालोनियों भी घने है या बहुत बड़ी हो गई है, वृद्धि हुई भेदभाव होता है. - बाहर कट, और किसी भी विभेदित iPSC कालोनियों संस्कृति passaging पहले हटायें.
- पूर्व एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गर्म Dispase के लिए आवश्यक मात्रा. आवश्यक मात्रा पर जानकारी के लिए नीचे एक टेबल के लिए संदर्भ लें.
- एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान for15 मिनट में KSR - एफएफ के लिए आवश्यक मात्रा पूर्व संतुलित. आवश्यक मात्रा पर जानकारी के लिए नीचे एक टेबल के लिए संदर्भ लें.
- संस्कृति एक विंदुक का उपयोग पोत से खर्च मध्यम Aspirate, और कोशिकाओं डी पीबीएस के साथ दो बार कुल्ला.
- धीरे संस्कृति पोत (उदाहरण के लिए, 60 मिमी संस्कृति डिश प्रति Dispase समाधान के 1 एमएल) के लिए पूर्व गर्म Dispase समाधान जोड़ें. पूरे कोशिका की सतह कोट संस्कृति पोत भंवर.
- 37 ° C पर 3 मिनट के लिए संस्कृति पोत सेते हैं.
- इनक्यूबेटर से पोत निकालें, Dispase समाधान aspirate, और धीरे डी पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो.
- धीरे बंद संस्कृति एक सेल खुरचनी का उपयोग पकवान की सतह कोशिकाओं खुरचना, और एक बाँझ 15ml अपकेंद्रित्र ट्यूब कोशिकाओं हस्तांतरण.
- संस्कृति डिश KSR - एफएफ के साथ दो बार, कुल्ला धीरे "बंद छिड़काव" किसी भी कोशिकाओं है कि अलग नहीं है. पूल 15ml ट्यूब में कोशिकाओं के साथ मध्यम कुल्ला.
- XG 200 पर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गोली कोशिकाओं को ट्यूब अपकेंद्रित्र.
- ध्यान से सेल गोली परेशान बिना aspirate सतह पर तैरनेवाला और इसे त्यागने.
- धीरे ट्यूब पूरी तरह से ट्यूब नीचे से सेल गोली बेदखल झटका.
- धीरे पूर्व equilibrated KSR - एफएफ में कोशिकाओं को एक 5ml सीरम वैज्ञानिक विंदुक का उपयोग resuspend. Triturate नहीं करो. नोट: यह धीरे बल प्रयोग करने के लिए क्षति से बचने के बिना कोशिकाओं resuspend कदम पर महत्वपूर्ण है.
- एक ताजा वांछित विभाजन के अनुपात में 60 मिमी Geltrex लेपित पकवान कोशिकाओं स्थानांतरण और संस्कृति डिश आगे और पीछे और साइड पक्ष कई बार इसकी सतह भर में कोशिकाओं को फैलाने के लिए कदम.
- संस्कृति डिश प्लेस की एक humidified वातावरण के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में4 से 6% हवा में सीओ 2.
- अगले दिन, धीरे KSR - एफएफ के साथ खर्च मध्यम जगह सेल मलबे को हटाने के. उसके बाद खर्च हर रोज मध्यम बदलें. आईपीएस कोशिकाओं दैनिक और उन्हें जरूरत के रूप में (लगभग हर 4-5 दिन) बीतने के निरीक्षण. Passaging की सिफारिश की है जब कोशिकाओं 70-80% संगम तक पहुँचने. आईपीएस सेल cryopreservation और विगलन के लिए, हमारे प्रोटोकॉल के लिए उल्लेख शीर्षक "Cryopreserving और मानव आईपीएस कोशिकाओं के पुनर्प्राप्त पूरा पीटा सीरम रिप्लेसमेंट फीडर मुफ्त मध्यम का उपयोग".
अपेक्षित परिणाम
चित्रा 1. चरण विपरीत छवि के नीचे Geltrex लेपित संस्कृति पूरा पीटा सीरम रिप्लेसमेंट फीडर मुफ्त माध्यम का उपयोग बर्तन पर हो IPSCs से पता चलता है . IPSCs आकारिकी hESCs, बड़े नाभिक और अल्प cytoplasm द्वारा विशेषता के लिए इसी तरह की एक्ज़िबिट. (40x बढ़ाई)
| घटक | 35 मिमी डिश | 60mm डिश | 100mm डिश |
| पूरा पीटा एसआर मध्यम | 2 एमएल | 4 एमएल | 10 एमएल |
| Geltrex समाधान | 1 एमएल | 1.5 एमएल | 4-5 एमएल |
| Dispase | 0.5 एमएल | 1 एमएल | 3-4 एमएल |
| Rinsing के लिए डी - पीबीएस | 2 एमएल | 4 एमएल | 10 एमएल |
तालिका 1. अनुशंसित खंड
कृपया परिशिष्ट को देख करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Disclosures
इस लेख के लेखक कि अभिकर्मकों और इस लेख में इस्तेमाल उपकरणों का उत्पादन जीवन टेक्नोलॉजीज द्वारा नियोजित कर रहे हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout DMEM/F12 | Cat. no. 12660-012 | Note: see appendix for the use of alternative DMEM products | |
| GlutaMAX-I | Cat. No. 35050-061 | ||
| KnockOut Serum Replacement | KnockOut SR, Cat. no. 10828-028 | ||
| KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail | KnockOut SR-GFC, Cat. no. A10580-01 | ||
| FGF-basic, human recombinant protein, 10 μg | bFGF, Cat. no. PHG0024 | Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes. | |
| 2-Mercapt–thanol | Cat. no. 21985-023 | ||
| Dispase | Cat. no. 17105-041 | Note: see appendix for alternative passaging methods. | |
| Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL | Cat. no. A10480-01 | ||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium | Cat. no. 14190-144 | ||
| Sterile Tissue Culture Hood | |||
| Incubator set at 37°C | |||
| Pipette-Aid | |||
| Water Bath set at 37°C | |||
| Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL) | |||
| Centrifuge | |||
| 15 mL centrifuge tubes | |||
| 60mm Tissue Culture treated dishes |
References
- Takahashi, K. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
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