Summary
Dit protocol beschrijft een high-throughput methode van enzymatische hydrolyse dat een microplaat lezer gebruikt om te meten en de bodem fosfor als P mono-esters, P di-esters en anorganische P. classificeren Tot 96 monsters kunnen worden gemeten op een bepaald moment in een standaard laboratorium.
Abstract
Veel soorten organische fosfor (P) moleculen bestaan in het milieu monsters 1. Traditionele P metingen niet te vertellen dat deze organische P-verbindingen omdat ze niet reageren met de colorimetrische reagentia 2,3. Enzymatische hydrolyse (EH) is een opkomende methode om nauwkeurig te karakteriseren van organische P vormen in milieumonsters 4,5. Deze methode is alleen trumped in nauwkeurigheid door Fosfor-31 nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (31 P-NMR)-een methode die is duur en vereist gespecialiseerde technische training6. We hebben een aangepast enzymatische hydrolyse methode geschikt voor het meten drie klassen van fosfor (P mono-ester, diester P en anorganisch P) om een microplaat reader systeem 7. Deze methode biedt onderzoekers met een snelle, nauwkeurige, betaalbare en gebruiksvriendelijke manier om P soorten te meten in bodem, sedimenten, meststoffen en, indien geconcentreerd, in het water levende monsters. Dit is de enige high-throughput-methode voor het meten van de formulieren en enzym-labiliteit van organische P die kan worden uitgevoerd in een standaard laboratorium. De resulterende gegevens geeft inzicht aan wetenschappers bestuderen van het systeem voedingswaarde en eutrofiëring potentieel.
Protocol
1. Fosfor Extraction
- Bereid een 1 liter oplossing van 0,25 M natriumhydroxide (NaOH, 40,00 g / mol) + 0.05 M Ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA, 292,24 g / mol).
- Voeg 30 mL van de NaOH + EDTA-oplossing tot 2 g van natte of droge bodem / monster in een 50 ml conische buis.
- Incubeer onder schudden gedurende 16 uur bij kamertemperatuur.
- Centrifuge 3000 xg gedurende 3 minuten.
2. Monsterextract pH-regeling
- De overdracht van een 0,1 ml hoeveelheid naar een 1,5 ml micro-centrifugebuis.
- Voeg 0,017 ml van 2,5 M azijnzuur, 0.144 ml van 0,4 M acetaat buffer (70,5% van natriumacetaat [CH 3 COONa, 82,03 g / mol] en 29,5% van azijnzuur, pH 5,0), en 0.739 ml gedeïoniseerd water.
- Het laatste deel van de gecorrigeerde extract wordt 1 ml worden en de uiteindelijke pH wordt 5,0.
3. Enzym stamoplossingen
- Bereid een L van 0,1 M natriumacetaat (CH 3 COONa, 82,03 g / mol) oplossing, pH 5,0.
- Bereid 2 x 10 ml zure fosfatase voorraad oplossingen in de natriumacetaatbuffer bereid in stap 3.1 zodanig dat eindconcentraties elk 0,5 eenheden / ml.
Zure fosfatase Type I van Triticum aestivum (tarwekiemen, GP, over het algemeen 0,5 mg U-1 vast, EC 3.1.3.2)
Zure fosfatase Type IV-S van Solanum tuberosum (aardappel, PP, over het algemeen 4,6 mg U-1 vast, EC 3.1.3.2)
* Eenheden van de activiteit worden gespecificeerd door de leverancier wanneer een eenheid is als de bevrijding van een micromol orthofosfaat aan de oplossing per uur bepaald bij 37 ° C. - Reconstitueer gevriesdroogde nuclease P1 (EG 3.1.30.1) van Penicillium citrinum (schimmels; NP1, over het algemeen 500 U mg -1 vast) in een ml gedeïoniseerd water-deze kan nu worden opgeslagen bij 4 ° C voor toekomstig gebruik.
- Pipetteer NP1 in een van de 10 ml buisjes bereid in stap 3.2 zodanig dat de uiteindelijke concentratie 2,5 eenheden / mL NP1; voorzichtig meng door een paar keer.
- Centrifugeer de twee 10 ml enzym-oplossingen 3.000 xg gedurende 30 minuten.
4. P Kalibratie Curve en Controls
- Bereid een L van 1 mM kaliumfosfaat (K2HPO4, 174,18 g / mol) stamoplossing.
- Voeg 1 ml van de 1 mM kaliumfosfaat stockoplossing aan een 1,5 ml centrifugebuis en het uitvoeren van zeven 0,5 ml seriële verdunningen.
- Gooi de eerste buis dus je hebt 7 verdunningen, variërend van 20 nmol-0.625 nmol P.
- Transfer 80 pi van elke buis, in tweevoud aan rijen B - H van een standaard 96-wells plaat.
- Voeg 80 ul van natriumacetaatbuffer (paragraaf 3.1) om een van de kolommen 11 en 12-dit is de 0 nmol P ijkpunt. Rij
- Elke kolom 11 en 12 bevat nu acht referentiemonsters van 0 tot 20 nmol nmol anorganisch fosfaat.
- Kolom 10 bevat de volgende besturingselementen:
- Voeg 40μL PP + GP enzymoplossing + 40 uL natriumacetaatbuffer (paragraaf 3.1) de eerste drie putten in kolom 10.
- Voeg 40 uL PP + GP + NP1 enzymoplossing + 40 uL natriumacetaatbuffer naar de volgende drie putten.
- Voeg 40 uL natriumacetaatoplossing met 10 nmol glucose-6-fosfaat (C 6 H 11 Na 2 O 9 P • xH 2 O, 304,1 g / mol) + 40 pi PP + GP enzym oplossing om een goed en tot de uiteindelijke goed in kolom 10 toe te voegen natriumacetaatoplossing in plaats van enzym-oplossing.
5. Voorbeeld + Enzyme Incubation
- Elk monster wordt getest zal bezetten de eerste negen waterputten in een rij van een standaard 96-wells plaat.
- Verdeel 40 ul van de pH-aangepast monsterextracten uit paragraaf 2 tot en met putten 1-9 in maximaal 8 rijen.
- Nadat alle monsters zijn verdeeld * gebruik maken van een multichannel pipet PP + GP enzym oplossing voor kolommen 1-3, PP + GP + NP1 kolommen 4-6 en natriumacetaatbuffer (opgesteld in paragraaf 3.1) om kolommen 7-9. Verdelen
* Deze stap moet snel worden uitgevoerd om te verzekeren alle monsters krijgen equivalent incubatietijd. - Dek de 96-wells plaat met een deksel en incubeer monsters + enzym-oplossingen, controles en kalibratiecurve precies 1 uur bij 37 ° C.
6. Colorimetrische Meting van Released en achtergrond Anorganische P
- Bereid 50 ml van elk van de volgende oplossingen in gedeïoniseerd water:
Oplossing A *: 0,1 M ascorbinezuur (C6H8O6, 176,12 g / mol) + 0,5 M trichloorazijnzuur (Cl3CCOOH, 163,39 g / mol)
Oplossing B: 0,01 M ammoniummolybdaat ((NH4) 2MoO4, 196,01 g / mol)
Oplossing C: 0,1 M natriumcitraat (HOC (COONa) (CH2COONa) 2 2H2O, 294,10 g / mol) + 0,2 M natrium-arsenaat (NaAsO2, 129,91 g / mol) + 5% ijsazijn
(CH3CO2H, 60,05 g / mol) * Oplossing A moet dagelijks worden voorbereid. - Voeg 25 ul van Solution SDS, 100 ul van Oplossing A, 20 pL Oplossing B en 50 il en van de Oplossing C aan alle putjes in de 96-well platen. Snel Doe dit met een multichannel pipet.
- Bedek de plaat en incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Meet de absorptie bij 850 nm in een afstembare micro-plate reader.
7. Classificatie van P-verbindingen
- Importeren ruwe data in een spreadsheet applicatie (bijvoorbeeld Microsoft Excel).
- Plot de anorganische fosfor kalibratiecurve: 0 tot 40 nmol P op de x-as en het gemiddelde van de dubbele absorptie metingen op de y-as.
- Voer een lineaire regressie en vind de vergelijking van de lijn van de beste pasvorm.
- Kolommen 1-3: rechtstreeks van toepassing zijn van de kalibratiecurve: dit is achtergrond anorganisch P.
- Kolommen 4-6: Gemiddelde drievoud sample waarden en aftrekken controles uit (enzymoplossing + achtergrond anorganisch P) van de bruto-absorptie-P dit is afgeleid van hydrolyseerbaar P mono-esters.
- Kolommen 7-9: Hetzelfde als 7.5, behalve aftrekken absorptiewaarden uit de kolommen 4-6 - dit is P van hydrolyseerbaar P diesters.
- Converteren absorptie gegevens naar nmol P vrijgegeven door het toepassen van de kalibratievergelijking.
- nmol P vrijgegeven kunnen worden gerelateerd aan mg P / kg van de oorspronkelijke bodem. Als alternatief kan de beoordeling aandeel van elke klasse P ook een nuttige benadering voor het analyseren van data.
8. Representatieve resultaten:
Een snelle visuele inspectie van de 96-wells plaat na de colorimetrische chemie zal bieden aanwijzingen over de vraag of de procedure correct is uitgevoerd. Het eerste ding om te controleren is het niveau van de vloeistof in elk putje door het scannen van het zijprofiel van de plaat. Er moet precies 275 pi van de reagentia in alle putten worden. Volgende visueel op de kleur van het drievoud monster putten en dubbele kalibratie putten. Deze technische repliceren moet dezelfde tint blauw zijn. Volgende toepassing van de ijkcurve om de twee putten met glucose-6-fosfaat en controleer brachten ze alle 10 nmol van anorganische P. Na het totaal geëxtraheerde P is gemeten met behulp van ICP-OES of een alternatieve methode, zorg ervoor dat de totale P-waarden berekend op basis van deze protocol niet hoger zijn dan de hoeveelheid P die werd gewonnen.
Let op: Zorgvuldig data management in de spreadsheet bescherming biedt tegen de kwantitatieve fouten. U krijgt te maken met een veel getallen in een keer, dus het maken van een template zal de tijd goed besteed worden.
Figuur 1. Een 96-well plaat met resultaten voor 8 monsters (rijen AH) en een ijkgrafiek (kolommen 11 en 12). De controles zijn in kolom 10. De kleurintensiteit te verhogen tussen de kolommen 1-3 en 4-6 te wijten aan gehydrolyseerd monoester P-verbindingen, tussen de kolommen 4-6 en 7-9 is te wijten aan gehydrolyseerd diëster P-verbindingen.
Figuur 2. Verdeling van P klassen in een 0,25 M NaOH-0.05 M EDTA uittreksel van een Vermont grondmonster met behulp van high-throughput enzymatische hydrolyse. Foutbalken geven de standaarddeviatie, n = 3.
Discussion
Door de aard, een snelle methode met behulp van kleine volumes vereist grote zorgvuldigheid. Daarom is de meest kritische stappen zijn die waarbij pipetteren oplossingen op de plaat. Accuraat, en vooral, consistent pipet techniek zijn van essentieel belang voor het succes van deze test.
De NaOH-EDTA-extractie zal het grootste deel van de P in veel monsters worden gekarakteriseerd in drie klassen: orthofosfaat, monoester P en diester P. bodem, mest, sedimenten of andere milieu-steekproef die NaOH-EDTA-extraheerbare P kan worden gekarakteriseerd bevat . P vormen in het milieu monsters zijn niet noodzakelijk stabiel en deze techniek zal zorgen voor monsters worden gekenmerkt voordat monsters worden aangetast zonder dat een leger van onderzoekers in dienst.
Deze test is vooral geschikt voor een groot aantal monsters moeten worden verwerkt. Het reagens noden en ruimte eisen zijn geschaald tot een beheersbaar niveau (bijvoorbeeld 1,5 ml microcentrifugebuizen in plaats van 50 ml glazen kolven). Deze aanpassing beperkt ook de productie van afval.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken de USGS en de Vermont Water Resources and Lake Studies Center voor het verstrekken van financiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 242853 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Wheat Acid Phosphatase | Sigma-Aldrich | P3627 | |
| Potato Acid Phosphatase | Sigma-Aldrich | P1146 | |
| Nuclease P1 | Sigma-Aldrich | N8630 | |
| Potassium Phosphate | Sigma-Aldrich | P2222 | |
| Glucose-6 Phosphate | Sigma-Aldrich | G7250 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4390 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| TCA | Sigma-Aldrich | T9159 | |
| Ammonium Molybdate | Sigma-Aldrich | A1343 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S1804 | |
| Sodium Arsenate | Sigma-Aldrich | S9663 |
References
- Turner, B. L., Frossard, E., Baldwin, D. S. Organic phosphorus in the environment. , Cabi Publishing. Wallingford. (2005).
- Murphy, J., Riley, J. P. A modified single solution method for determination of phosphate in natural waters. Anal. Chim. Acta. 27, 31-36 (1962).
- Dick, W. A., Tabatabai, M. A. Determination of orthophosphate in aqueous solutions containing labile organic and inorganic phosphorus compounds. J. Environ. Qual. 6, 82-85 (1977).
- He, Z., Toor, G. S., Honeycutt, C. W., Sims, J. T. An enzymatic hydrolysis approach for characterizing labile phosphorus forms in dairy manure under mild assay conditions. Bioresour. Technol. 97, 1660-1668 (2006).
- He, Z., Honeycutt, C. W. A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates. Commun. Soil Sci. Plant Anal. 36, 1373-1383 (2005).
- Cade-Menun, B. J. Characterizing phosphorus in environmental and agricultural samples by 31P nuclear magnetic resonance spectroscopy. Talanta. 66, 359-371 (2005).
- Johnson, N. R., Hill, J. E. Phosphorus species composition of poultry manure-amended soil using high-throughput enzymatic hydrolysis. Soil Sci. Soc. Am. J. 74, 1786-1791 (2010).
