采用干涉反射成像传感器（IRIS）进行生物分子检测

摘要

在SiO₂表面，利用一种简单的干涉测量技术，可实现对生物分子（如DNA、蛋白质等）的定量、高通量、实时且无需标记的检测。该技术依赖LED照明、极少的光学元件和一台相机。干涉反射成像传感器（IRIS）成本低廉、操作简便，并适用于微阵列格式。

摘要

生物分子相互作用的灵敏检测在基础生物学和微生物学、环境/农业/生物防御监测、纳米生物技术等多个领域和行业中具有广泛应用。在诊断应用中，通过监测（检测）患者样本中靶向蛋白质组或基因组生物标志物的存在、缺失或异常表达，可用于确定治疗方案或评估治疗效果。在科研领域，分子亲和力和特异性信息有助于全面表征被研究的系统。

目前用于测定分子浓度或亲和力的许多系统依赖于标记物的使用。这些系统的例子包括酶联免疫吸附测定（ELISA）等免疫分析法、聚合酶链式反应（PCR）技术、凝胶电泳分析以及质谱法（MS）。通常，这些标记物具有荧光性、放射性或比色性质，并被直接或间接地连接到目标分子上。尽管标记物的使用已被广泛接受并具有一些优势，但其缺点正在推动新型无标记方法的发展，以用于测量这些相互作用。这些缺点包括一些实际方面的因素，如检测成本增加、试剂的保质期和可用性、储存与安全问题、标记过程所耗费的时间和精力，以及由于标记过程或标记物本身导致的不同试剂之间的变异性。从科学研究的角度来看，使用这些标记物还可能带来一些困难，例如标记物的存在可能影响蛋白质的功能或结构，以及无法实时直接测量分子间的相互作用。

本文介绍了一种新型无标记光学生物传感器的应用，该传感器适用于微阵列研究，称为干涉反射成像传感器（Interferometric Reflectance Imaging Sensor, IRIS），可用于检测蛋白质、DNA、抗原物质、完整病原体（病毒颗粒）及其他生物材料。IRIS系统已被证实对不同的生物分子相互作用具有高灵敏度、高精确度和良好的重复性[1-3]。其优势包括多重成像能力、实时和终点测量功能，以及其他高通量特性，如试剂消耗量少、检测时间缩短。此外，IRIS平台操作简便，所需设备成本低廉，并采用基于硅的固相检测组件，因此可与当前多种表面化学方法兼容。

本文介绍了IRIS系统从探针阵列制备到靶标结合孵育及检测，直至终点式结果分析的完整应用流程。模型系统为在HSA点样基底上捕获针对人血清白蛋白（HSA）的特异性靶向抗体。

方案

1. 底物制备

1. 用自吸附共聚物 DMA-NAS-MAPS 涂覆分层硅-SiO₂ 基底：
   1. 共聚物的合成、化学结构及涂覆工艺发表于：G. Pirri, F. Damin, M. Chiari, E. Bontempi, L.E. Depero. 用于DNA微阵列玻片的聚合物吸附涂层的表征. Anal. Chem. 2004, 76, 1352-58。
   2. 简而言之，将100 mg聚合物加入5 mL去离子（DI）水中配制聚合物溶液，并加入5 mL 40%饱和硫酸铵（(NH₄)₂SO₄）溶液，使终浓度达到0.92 M。
   3. 将芯片置于溶液中，在摇床上浸泡30分钟，然后用去离子水充分冲洗，并用氩气/氮气彻底吹干。
   4. 在80 °C下烘烤芯片15分钟。
2. 将聚合物涂覆的基底/芯片储存于干燥环境（真空干燥器）中，最长可保存3个月，直至进行探针点样操作。

2. 探针阵列的制备：抗体、抗原、单链/双链DNA、RNA等

1. 将探针稀释至所需缓冲液中的适当浓度。此步骤可能差异较大，但典型的实验通常在 pH≈7.4 的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中使用浓度为 0.5 mg/mL（范围为 0.1–1 mg/mL）的抗原或 IgG。
2. 将溶液置于 96 孔或 384 孔板中（或根据所用点样仪的要求使用标准源板）。
3. 设置所需打印阵列的点样参数：确定适用于所用表面和溶液的点样参数（停留时间、接近速度等）。确定每个网格中每种条件的重复次数、网格布局、重复网格的数量以及芯片上的目标点样位置。将基底和源板放置在相应位置，检查废液瓶和试剂瓶是否准备就绪，然后开始打印运行。
4. 点样完成后，将基底置于高湿度环境中过夜（4–18 小时），以促进固定化和失活过程的进行。
5. 洗涤基底：依次在以下溶液中各洗涤三次，每次三分钟：含 0.1% Tween 的 PBS（PBST）、PBS，最后为去离子水（DI 水）。根据实验类型（湿法或干法），用氩气彻底干燥芯片后开始孵育，或将芯片放入流动池中并完成组装。
6. 通过将芯片浸入 pH 调至 7.4 的 50 mM 乙醇胺溶液中 30 分钟（同时置于摇床上），使共聚物表面残留的 NHS 基团失活。也可使用其他含伯胺的化合物（如羟胺或 Tris），只要配制的溶液对蛋白质安全即可。随后用 PBS 充分冲洗，再用去离子水彻底清洗。
7. 可选步骤（取决于所采用的表面化学）：使用 BSA、酪蛋白或复溶脱脂奶粉溶液封闭表面 30 分钟。对于我们目前使用的聚合物表面化学体系，此步骤无需进行，因为聚合物骨架本身即可防止非特异性蛋白结合。

3. 数据采集与孵育程序：终点法格式

1. 在所需的缓冲液中制备目标物的溶液。此处，应为PBS中适当浓度的抗BSA溶液（例如：制备1–10 mL浓度为10 ng/mL的抗BSA PBS溶液）。同时，确保准备等量不含目标物的缓冲液，用于阴性对照孵育。
2. 采集硅镜的扫描数据，用于归一化后续所有采集的数据。
3. 在孵育步骤之前，使用IRIS系统扫描已制备的探针阵列，以确定每个点的初始光学高度（质量）。这将有助于在孵育后对表面质量变化（即结合水平）进行准确分析。在此过程中，需根据当前实验调整若干参数，如曝光时间、视场、精确对焦等。
4. 将芯片浸入已制备的溶液中，在摇床平台上孵育1小时。孵育时间可根据振荡强度、待检测目标物的浓度、流动室的传质特性（若采用实时检测模式）、目标物与探针之间的亲和力等因素而有较大变化。
5. 孵育结束后，重复步骤2.5中所述的洗涤程序。
6. 使用IRIS系统再次扫描同一探针阵列，并获取孵育后的图像，以便与孵育前进行比较。
7. 如有必要，可重复此过程进行不同的孵育步骤，例如在夹心法检测中使用二抗的情况。

4. 数据分析

1. 使用实验室开发的软件对每次 IRIS 扫描（一系列强度图像）所采集的图像进行拟合，生成包含光学厚度信息的探针阵列图像。通过减去（已配准的）孵育后与孵育前的图像，可快速进行结合情况的定性分析。在发生质量变化的位点，结合现象将表现为强度的变化。对于定量分析，通过分别对每个位点内像素及其外围环形区域的光学厚度信息进行平均，并直接比较这两个区域，从而确定每个位点相对于背景的质量密度。

5. 代表性结果：

图1展示了一个分层的Si-SiO₂ IRIS基底的示意图，其上点样有代表性的抗体阵列。每种抗体组合均以重复形式点样，分别特异性识别不同蛋白质上的不同表位。图中以两种不同的完整病毒和一种病毒蛋白作为示例靶标。阴性对照抗体取决于具体检测方法，可为非特异性抗体和/或病毒特异性抗体。

图2显示了人血清白蛋白（HSA）特异性抗体与点样在芯片上的HSA及兔IgG（对照）位点的结合情况。如图所示，在对孵育前和孵育后的图像进行拟合并确定其光学厚度后，可生成结合阵列的差值图像，以定性评估结合效果。定量分析结果显示，在抗HSA抗体孵育浓度为500 ng/mL时，HSA位点和兔IgG位点的平均光学高度变化分别为2.05纳米和0.13纳米。

图3展示了Fur蛋白结合对蛋白浓度和双链DNA寡核苷酸长度的依赖性的IRIS测量结果。上方图表显示了初始固定的寡核苷酸探针高度以及孵育后Fur结合的绝对光学高度测量值。随着Fur浓度的增加（50、100、200 nM），其与DNA探针的结合量也随之增加。寡核苷酸的长度也影响Fur的结合，较长的序列导致更多的结合。此处误差线表示均值的一个标准差。下方图表显示了每条双链DNA链上计算得到的Fur蛋白二聚体结合量。在Fur蛋白浓度为200 nM时，二聚体结合显著增加，提示存在高水平的非特异性结合。

图1. 在实验中通常使用的一种探针阵列示意图，用于通过IRIS系统以多重方式检测特定病毒及病毒组分。

图2. 人血清白蛋白特异性抗体与点样HSA结合后，通过该无标记系统在500 ng/mL浓度下采集的孵育后差分图像。每个点的生物材料面密度通过计算点内光学厚度信息的平均值，并将其与代表背景的围绕该点的环形区域的平均值进行比较而确定。

图3. 基于已知共识序列的点样双链寡核苷酸长度、共识序列在寡核苷酸中的位置以及Fur蛋白浓度，Fur蛋白与这些寡核苷酸相互作用的结合数据图。可通过上图中每种点样序列结合的Fur蛋白绝对量信息，估算每种寡核苷酸结合的Fur二聚体数量（下图）。

讨论

IRIS 平台是一种简单且快速的系统，可用于以微阵列形式收集高通量结合数据。通过将不同的功能蛋白或 DNA 探针共价固定在表面，可从溶液中捕获目标抗原、生物标志物等，类似于免疫测定。利用 IRIS 系统以终点或实时方式测量这些探针条件下的相互作用，可为每种相互作用收集高灵敏度和定量的信息。此处详述的代表性实验仅是该技术可研究的相互作用类型之一。此前已成功检测转录因子、病毒抗原及完整病毒，这些仅是 IRIS 能够轻松处理的分析类型的几个示例。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带有500 nm热生长二氧化硅的硅晶圆	Silicon Valley Microelectronics
硫酸铵粉末	Sigma-Aldrich	A5132
磷酸盐缓冲液（PBS）10X即用型浓缩液	Fisher Scientific	BP665-1
人血清白蛋白抗体（Anti-HSA）	Sigma-Aldrich	A0433
人血清白蛋白（HSA）	Sigma-Aldrich	A9511
氩气或氮气（超高纯度）	Airgas	AR UHP300 或 NI UHP300
培养皿，60 mm × 15 mm	Fisher Scientific	0875713A
Scienceware® 真空干燥器	Sigma-Aldrich	Z119016
微量离心管	Fisher Scientific	05-408-120
96孔板，低细胞结合	Nalge Nunc International	145399
BioOdyssey Calligrapher MiniArrayer	Bio-Rad
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379
乙醇胺	Sigma-Aldrich	398136
羟胺	Thermo Fisher Scientific, Inc.	26103
多功能旋转仪，型号 #2314	Thermo Fisher Scientific, Inc.	2314Q
Retiga 2000R 相机	QImaging	01-RET-2000R-F-M-12
AcuLED 照明光源	PerkinElmer, Inc.
光学元件（透镜、物镜、光阑、导轨、支架等）	Thorlabs Inc.