Summary
Denna artikel skildrar inspelningen av enskilda celler från fluorescerande taggade neuronala populationer i den intakta musen näthinnan. Genom att använda två-photon infraröd excitation transgenetically märkta celler riktade för patch-clamp in för att studera deras ljus svar, mottaglig egenskaper fältet och morfologi.
Abstract
Att studera den fysiologiska egenskaper och synapsförbindelser av specifika nervceller i intakt vävnad är en utmaning för de celler som saknar synliga morfologiska egenskaper eller visa en låg befolkningstäthet. Detta gäller särskilt näthinnans amakrina celler, en ovanligt mångskiftande klass av interneuronen som omfattar omkring 30 subtyper hos däggdjur 1. Även att vara en viktig del av den visuella bearbetningen genom att forma retinala utgång 2, har de flesta av dessa subtyper inte studerats hittills på ett funktionellt sammanhang eftersom möter dessa celler med en inspelning elektrod är en sällsynt händelse.
Nyligen har en mångfald av transgen mus linjer som finns att uttrycka fluorescerande markörer som grönt fluorescerande protein (GFP) under kontroll av initiativtagarna till membran receptorer eller enzymer som är specifika för endast en delmängd av nervceller i en viss vävnad 3,4. Dessa pre-märkta celler är därför accessible för att riktade mikroelektrod inriktning i mikroskopisk kontroll, möjliggör systematisk studie av deras fysiologiska egenskaper på plats. Det är dock excitation av fluorescerande markörer tillsammans med risken för fototoxicitet för levande vävnad. I näthinnan är denna metod hindras dessutom av problemet som excitation ljus orsakar lämplig stimulering av fotoreceptorer, och därmed orsakar photopigment blekning och överföring av näthinnans kretsar till ett anpassat ljus-tillstånd. Dessa nackdelar kan övervinnas med hjälp av infraröd excitation levereras av ett läge låst laser i korta pulser av femtosecond sortimentet. Två-foton excitation ger energi tillräckligt för fluoroforen excitation och samtidigt begränsar excitation till en liten vävnad volym minimera riskerna med fotoskador 5. Dessutom lämnar näthinnan mottaglig för visuella stimuli sedan infrarött ljus (> 850 nm) är bara dåligt absorberas av photopigments 6.
in situ inspelningar från GFP-uttryckande celler som visuellt är måltavla för två-photon excitation. Näthinnan är beredd och underhålls i mörker och kan utsättas för optiska stimuli som projiceras genom kondensorn i mikroskop (Figur 1). Patch-clamp inspelning av ljus svar kan kombineras med färg fylla avslöja morfologi och att kontrollera för gap junction-medierad färgämne koppling till angränsande celler, så att målcellen kan genom att studera på olika experimentella nivåer.
Protocol
Följande beskrivning förutsätter att försöksledaren har en grundläggande förståelse av näthinnans struktur, patch-clamp inspelning, och två foton mikroskopi. Användbar information om att etablera och driva en patch-clamp installation och två-photon bildsystem se Refs [7-12].
1. Djur och vävnad förberedelse
- Håll musen mörka anpassad för minst 3 timmar Under tiden förbereder 1-2 l extracellulära lösning bestående av (i mm) 125 NaCl, 2,5 KCl, 1 CaCl 2, 1,6 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 10 D-glukos och balansera det till pH 7,4 genom gasning med carbogen (5% CO 2 i O 2) vid rumstemperatur. en
- Euthanize musen i en lufttät kammare av CO 2 överdos följt av halsdislokation. Detta förfarande och följande steg ska utföras i mörker. Använd dim lång våglängd belysning (vi blockerar korta våglängder från en kall ljuskälla med en 690 nm-longpass filter) för att stödja personliga vision samtidigt som djurets ögon mörka anpassas (möss bara har dålig syn i den röda delen av ljusspektrum). För arbete i totalt mörker med infraröd belysning (> 800 nm) och bär glasögon för mörkerseende.
- Enucleate ögonen med ett par böjda iris sax och överföra dem till en maträtt av extracellulära lösning som hänförts till ett dissekera mikroskop.
- Ta bort hornhinnan och ciliarkroppen genom att öppna ögat lampa längs ora serrata (gränsen mellan näthinnan och ciliarkroppen) med ett par av vårens sax (vi först använda en lansett att genomborra en utgångspunkt för styckning). Ta ut linsen och noggrant åtskilda näthinnan från pigmentepitel. Om riktningen på näthinnan är avgörande för dina studier, ange det som i ref [12]. Skär den optiska nerven mellan näthinnan och pigmentepitel och ta bort näthinnan från ögonmusslan. Observera riktningen av näthinnans ytor: insidan av hoprullade upp näthinnan är ganglion cell sida, utsidan är ljusmätare sida.
- Ta bort glaskroppen från den inre näthinnan ytan genom att försiktigt dra bort det med hjälp av en trä tandpetare. För detta ändamål använder en liten mängd extracellulära lösning som bara täcker näthinnan. Glaskroppen fastnar på tandpetare och kan dras centrifugalgjuten bort från näthinnan. Sedan gäller korta snitt längs med näthinnan omkrets för att underlätta flackare vävnaden.
- Överför näthinnan i inspelningen kammaren ljusmätare och ner, sprida ut det på glaset botten (vi använder en fin pensel) och immobilisera den med en nylon-uppträdda stomme av rostfritt stål. Förbered den andra näthinnan på samma sätt och hålla det mörkt anpassas carboxygenated extracellulära lösning för senare användning.
2. Inspelningar
- Installera inspelningen kammare i mörkret under en upprätt laser scanning mikroskop och superfuse näthinnans preparatet kontinuerligt (inte mindre än 5 ml / min) med carboxygenated extracellulära lösning uppvärmd till 35 ° C. Mikroskopet (också utrustad med en infraröd-känslig CCD-kamera) ligger på en stötdämpande luft bord inne i en Faradays bur för elektronisk avskärmning. Täck över buren med en icke-transparent gardin för att hålla beredningen i mörker. Vi visar också av ljuset från datorskärmar med röd transparent film.
- Ställ in infraröd laser till 850-870 nm eller längre våglängder, byta till modlåsta skick och använda två-photon excitation att visualisera GFP-uttryckande celler. Dämpa lasern utgång med neutrala täthetsfilter kontrolleras av laserscanning programvaran ner till en grad som är precis tillräckligt för att tydligt erkännande av fluorescerande celler
- För patch-clamp inspelningar i nuvarande-clamp glas läge Använd mikropipetter (vi använder borosilikatglas slangar med 1,5 mm ytterdiameter och 0,225 mm väggtjocklek) fylld med intracellulär lösning bestående av (i mm) 125 K-glukonat, 10 KCl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, titreras till pH 7,4 med KOH (som ger en pipett motstånd ca 5 Mohm). Observera att andra experimentella förhållanden som spänning-clamp inspelning kräver en annan lösning. Om dye injektioner önskas, lägga till en fluorescerande prob (vi använder 10 mM Alexa Fluor 594) eller ett spårämne molekyl (3% Neurobiotin). Sätt mikropipett i hållaren och se till att referenselektrod (klorerade silvertråd) är i kontakt med den extracellulära lösningen i inspelningen kammaren.
- Tryck mot mikropipett och rikta en GFP-uttryckande celler (vi använder en 40-faldig mål nedsänkning i vatten, NA 1,25). Amakrina cell organ är belägna i ganglion cellager (direkt under ytan i den nuvarande inriktningen av näthinnan) samt i den proximala delen av det inre nukleära lagret (ca 55-75 ìm djupt inom beredningen). Innan mikropipett kontakt med riktade cellen, det inre begränsa membranet (ett hölje av gliaceller endfeet) på näthinnanYtan måste penetreras. Framgångsrik penetration noteras av intracellulära lösning som drivs ut från mikropipett spets och lossnar det inre begränsa membranet från den underliggande retinal vävnad som kan observeras på en IR-överföring videobild som tas med IR-CCD-kamera.
- Tillvägagångssätt önskade cellen genom att jämföra Soma läge från två-photon bild med den bild av IR-CCD-kamera som visar läget för inspelningen mikropipetten. Observera att detta steg inte lätt uppnås och kräver lite övning, eftersom GFP-uttryckande celler måste redovisas i IR-överföring bilden för att styra mikropipett mot den. Korrekt inriktning uppnås när mikropipett spetsen orsakerna dimpling av cellytan som kan ses i två-fotonen bild. Alternativ till detta förfarande, använd en fluorescerande färg (t.ex. Alexa Fluor 594, 100 M) i de intracellulära lösningen att avslöja mikropipett position i två-photon bild. Två-foton infraröd excitation tillåter tillräckligt fluorescens av denna färg för att göra mikropipetten skönjas. För detta ändamål justera detektionsområde i laserscanning programmet till att omfatta även röd fluorescens.
- Släpp trycket från mikropipett och få en hel-cell patch-clamp konfiguration i ström-klämma-läge. En användbar inspelning bör ge en membranpotential på -50 till -55 mV och pågå i minst 20 min.
- Nuvarande visuella stimuli som skapats av en stimulering programvara (vi använder QDS av Thomas Euler, universitetet i Tübingen, Tyskland) 11 på en datorskärm. Justera den rumsliga placeringen av stimulans för att vara inriktade på det inspelade cellen: Markera cellen position på skärmen som visar överföringen bild av IR-CCD-kamera och centrum en plats-liknande stimulans på den. Trimma stimulusintensitet genom att sätta in neutral density filter i strålgången. För kalibrering av bildskärm spektrum och intensitet se Ref [14]. Välj ett PROLONGEd interstimulus intervall (t.ex. 15 s) för att undvika anpassning. Inkludera en fotodiod inom strålens väg att föra register över den stimulans timing.
- Starta stimuleringen protokollet och registrera ljus svar (vi använder en samplingsfrekvens på 10 kHz med filtrering på 5 kHz för ej tillsatta celler, för spika in en högre samplingsfrekvens som 20 kHz rekommenderas). Använd ljuset stimulans programvara för att utlösa inspelningsprogram.
- För dye fylla låt fluorescerande agenten diffusa i inspelade cellen i 30-45 min innan försiktigt dra tillbaka mikropipett från cellen. Se till att inte dra ut cellkroppen. Om den icke-fluorescerande spårämne Neurobiotin användes måste det visualisering genom att binda till streptavidin konjugerat till en fluoroforen (vi använder streptavidin-Cy3, 1:400 över natten vid 4 ° C efter 20 min paraformaldehyd fixering av näthinnan, för dye-koppling studier streptavidin inkubationstiden kan förlängas till 3 d). Alternativt kan injektionerna också utföras medskarpa elektroder (> 100 Mohm) när färgen drivs iontophoretically i spetsad cellen (rektangulära pulser: 0,25-1 nA, 100 ms, intervall 100 ms, total tid 3-6 min).
3. Representativa resultat:
Följande resultat kommer från en studie på en mus som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) under promotor för tyrosin hydroxylas 13,14, det enzym som katalyserar det hastighetsbegränsande steget i katekolamin syntes (TH:: GFP mus). Baserat på ljusstyrkan på GFP-signal två olika cellpopulationer skiljer (Figur 2A). Celler som uttrycker den högre GFP nivå besitter cell organ i det inre nukleära lagret (INL, figur 2A) eller fördrivna i ganglion cellager (GCL, figur 2B) och stratifiera i mitten av det inre plexiform lagret (IPL, Figur 2C) . De identifierades som typ 2-celler 14-16 och kunde systematiskt studeras med avseende på morfologi (figur 3) och väljasymmetrisk aktivitet (Figur 4) trots att befolkningstätheten uppgår endast till 250 celler / mm 2.
Figur 1. Schematisk bild av experiment. Två-foton excitation (röd streckad ljus sökväg) fluoroforen-innehållande celler i intakta näthinnan ger visuell inriktning på en mikropipett (grön utsläpp strålgång). Näthinnan utsätts för optisk stimuli projiceras genom kondensorn i mikroskop (gult ljus stig) och cellulära lätta svar registreras.
Figur 2. GFP-uttryckande celler i en retinal flatmount av TH:: GFP mus. Två populationer kan särskiljas genom ljusstyrkan på GFP-signal: typ 1 celler (DA celler) som ligger i INL visar svag fluorescens (A, se pilspetsar) och intensivt märkt typ 2-cellermed cell organ antingen i INL (A, se pilar) eller förflyttas i GCL (B) och ett dendritiska skiktning i stratum S3 av IPL (C). Skala barer, 50 ìm.
Figur 3. Morfologi av en typ 2-cell injiceras med tracer Neurobiotin. Det spårämne därefter visualiseras genom streptavidin-Cy3 bindande (magenta). Den mikroskop, som också skildrar GFP signal (grön), är en projektion av bild stackar som täcker GCL och IPL. Skala Bar, 50 ìm.
Figur 4. Ljus svar av en typ 2-cell ligger i GCL. Svar mönster vitt ljus fullt fält belysning för att öka intensiteten i scotopic sortimentet. Stimulusintensitet ges i photoisomerizations per spö per sekund (Rh * / stav / s). En långvarig stimulans av 3 s har använts för bättre distinktaion av svaret komponenter vid stimulus debut (på svar) och offset (svarstid).
Discussion
Denna metod ger möjlighet att studera elektriska egenskaper av specifika nervceller i intakta näthinnan i visuell vägledning utan att påverka adaptational skick näthinnan. Det är särskilt lämpade för karakterisering av celler som för närvarande ganska dåligt studerat beror på låg befolkningstäthet som de flesta populationer av amakrina celler. Två-foton excitation tillåter hög upplösning och hög kontrast bildbehandling även från djupare delar av vävnaden 17, en förutsättning för korrekt inriktning och framgångsrika patch-fastspänning av celler i synnerhet i INL med hög täthet av cellens organ.
De isolerade musen näthinnan är lönsamt för 3-4 timmar under experimentella förhållanden. Om den andra näthinnan lagras i totalt mörker under kontinuerlig carbogen gasning, behåller den lila färgen på oblekt photopigment och kan användas efter avslutat experiment med den första näthinnan. I början, med inriktning påcellen med mikropipett i näthinnan wholemount är lite utmanande och kräver lite övning, speciellt vid arbete i mörker. Inklusive en fluorescerande färg i mikropipett kan förenkla förfarandet, eftersom cellen och mikropipett syns under två-photon excitation på samma gång. Kan dock lägga till komponenter till den intracellulära lösningen hindrar gigaseal bildning eller orsaka inspelningskvalitet att lida. När framgång uppnås, kan en bra inspelning pågå i cirka 1 timme
De infraröda excitation ljuset i sig är bara dåligt absorberas av retinala fotoreceptorer, upphetsad GFP-uttryckande celler avger ljus i den synliga delen av spektrumet. Men fluoroforer glada bara i en liten fokus volym som sannolikt inte kommer att ändra adaptational skick näthinnan. Desto mer, magnetisering behövs endast för inriktning och kan stängas av under inspelning av ljus svar.
Den usefulnESS i denna strategi har redan visat studier på specifika populationer av amakrina celler 14,18 från vilken elektrofysiologiska inspelningar annars skulle ha varit möjligt endast genom olyckshändelse 12. Slutligen kan denna kraftfulla teknik ytterligare förlängas genom att ta med en farmakologisk metod 14, Ca 2 + avbildning 19 eller via injiceras celler för immuncytokemiska studier eller elektronmikroskopi. På så sätt kan den funktionella positionen för en viss celltyp i näthinnan kretsar redas ut.
Disclosures
Möss har hanterats och avlivas i enlighet med institutionella riktlinjer för djurskydd och lagarna om djurförsök utfärdas av den tyska regeringen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft (WE849/16 1 / 2 till KD och RW). Vi är tacksamma för Thomas Euler (Töbingen, Tyskland) för ljuset QDS stimulans programvara.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Night-vision goggles | Gutzeit GmbH, Warthausen, Germany | Xtron F1 | includes a 800 nm light source |
| Optical filter | Schott AG | RG9 | longpass filter with cutoff at 690 nm |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | curved with 22 mm blade |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | straight with 3 mm blade |
| Recording chamber | Luigs & Neumann | 200-100 500 0180 type A(TC) | Teflon chamber with bottom-mounted glass cover slip (approx. 0.15 mm; No. 200-100 500 0182) |
| Flow heater | Multi Channel System MCS GmbH | PH01, TC01 | heatable perfusion cannula with temperature sensor and temperature controller |
| Laser scanning microscope | Leica Microsystems | DM LFS | controlled by Leica Confocal Software |
| Air table | Newport Corp. | VH 3036W-OPT | |
| Laser | Newport Corp. | Tsunami Mode-locked Ti:sapphire laser | |
| CCD camera | pco AG, Kelheim, Germany | PixelFly QE | including control software |
| Micropipette glass capillaries | Hilgenberg, Malsfeld, Germany | 1408411 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-20004 | fluorescent dye |
| Neurobiotin | Axxora | VC-SP-1120-M050 | non-fluorescent tracer |
| Streptavidin-Cy3 | Dianova | 016-160-084 | |
| Micromanipulator | Luigs & Neumann | 210-100 000 0010 | motorized Mini25 manipulator unit with display SM-5 |
| Patch-clamp amplifier | npi electronic | SEC-05LX npi | |
| Digitizer | National Instruments | BNC-2090 | |
| Data acquisition software WinWCP | John Dempster, University of Scotland, Glasgow, UK | http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/ software.htm | |
| Visual stimulus generator QDS | Thomas Euler, University of Tübingen, Germany | has to be operated on a separate computer controlling 2 monitors (user interface, stimulus monitor) | |
| Neutral density filters | ITOS, Mainz, Germany |
References
- Masland, R. H.
- Baccus, S. A. Timing and computation in inner retinal circuitry. Annu. Rev. Physiol. 69, 271-290 (2007).
- Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wässle, H. Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines. Neuroscience. 160, 126-139 (2009).
- Siegert, S., Gross-Scherf, B., Del Punta, K., Didkovsky, N., Heintz, N., Roska, B. Genetic address book for retinal cell types. Nat. Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Euler, T., Detwiler, P. W., Denk, B. Directionally selective calcium signals in dendrites of starburst amacrine cells. Nature. 418, 845-852 (2002).
- Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Plenum Press. (1995).
- Jackson, M. B. Whole-cell voltage clamp recording. Current Protocols in Neuroscience. Gerfen, C. , Wiley. (1997).
- Majewska, A., Yiu, G., Yuste, R. A custom-made two-photon microscope and deconvolution system. Pfügers Arch. - Eur. J. Physiol. 441, 398-408 (2000).
- Yuste, R., Konnerth, A. maging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory. (2005).
- Euler, T., Hausselt, S. E., Margolis, D. J., Breuninger, T., Castell, X., Detwiler, P. B., Denk, W. Eyecup scope - optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina. Pflügers Arch. - Eur. J. Physiol. 457, 1393-1414 (2009).
- Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nat. Protoc. 5, 1347-1352 (2010).
- Matsushita, N., Okada, H., Yasoshima, Y., Takahashi, N., Kiuchi, K., Kobayashi, K. Dynamics of tyrosine hydroxylase promoter activity during midbrain dopaminergic neuron development. J. Neurochem. 82, 295-304 (2002).
- Knop, G. C., Feigenspan, A., Weiler, R., Dedek, K. Inputs underlying the ON-OFF light responses of type 2 wide-field amacrine cells in TH-GFP mice. J. Neurosci. 31, 4780-4791 (2011).
- Zhang, D. Q., Stone, J. F., Zhou, T., Ohta, H., McMahon, D. G. Characterization of genetically labeled catecholamine neurons in the mouse retina. Neuroreport. 15, 1761-1765 (2004).
- Contini, M., Lin, B., Kobayashi, K., Okano, H., Masland, R. H., Raviola, E. Synaptic input to ON-biploar cells onto the dopaminergic neurons of the mouse retina. J. Comp. Neurol. 518, 2035-2050 (2010).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Dedek, K., Breuninger, T., de Sevilla Müller, L. P., Maxeiner, S., Schultz, K., Janssen-Bienhold, U., Willecke, K., Euler, T., Weiler, R. A novel type of interplexiform amacrine cell in the mouse retina. Eur. J. Neurosci. 30, 217-228 (2009).
- Denk, W., Detwiler, P. B. Optical recording of light-evoked calcium signals in the functionally intact retina. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 7035-7040 (1999).
