Summary
A continuación se describe el uso de un auto-montaje de andamios de 3 dimensiones para cultivo de células progenitoras neurales humanas. Se presenta un protocolo para liberar las células de los andamios para ser analizados posteriormente por ejemplo, mediante citometría de flujo. Este protocolo puede ser adaptado a otros tipos de células para llevar a cabo estudios detallados de manera mecánica.
Abstract
La influencia de tres dimensiones (3D) los andamios en la diferenciación de crecimiento, la proliferación neuronal y por último es de gran interés con el fin de encontrar nuevos métodos de terapias basadas en células y estandarizada en las enfermedades neurológicas o enfermedades neurodegenerativas. Estructuras 3D se espera que proporcionen un ambiente mucho más cercano a la situación in vivo de las culturas en 2D. En el contexto de la medicina regenerativa, la combinación de biomateriales con madre neurales y las células progenitoras es una gran promesa como una herramienta terapéutica. 1.5 Los sistemas de cultivo que simula un entorno tridimensional se ha demostrado que influyen en la proliferación y diferenciación en diversos tipos de células madre y las células progenitoras. En esto, la formación y funcionalización de la 3D-microenviroment es importante para determinar la supervivencia y el destino de las células incrustado. 6-8 Aquí usamos PuraMatrix 9,10 (RADA16, PM), un péptido de hidrogel a base de andamios,que está bien descrito y utilizado para estudiar la influencia de un entorno 3D en diferentes tipos celulares. 7,11-14 PuraMatrix se pueden personalizar fácilmente y la fabricación sintética de la nano-fibras proporciona un sistema de cultivo en 3D de alta fiabilidad, que es, además de xeno-libre.
Recientemente se ha estudiado la influencia de la concentración de PM-en la formación del andamio. 13 En este estudio las concentraciones utilizadas de PM tuvo un impacto directo sobre la formación de la estructura 3D, que fue demostrado por microscopía de fuerza atómica. Un posterior análisis de la supervivencia y la diferenciación de la hNPCs reveló una influencia de las concentraciones utilizadas de PM en el destino de las células incrustado. Sin embargo, el análisis de la supervivencia o la diferenciación neuronal por medio de técnicas de inmunofluorescencia poseen algunos obstáculos. Para obtener datos fiables, hay que determinar el número total de células en una matriz para obtener el número relativo de ejemplo. células neuronales marcados por βIII-tubulina. Este pre-requisitos de una técnica para analizar los andamios en todas las dimensiones de 3 por un microscopio confocal o una técnica comparable como los microscopios de fluorescencia capaces de tomar z-pilas de la muestra. Además, este tipo de análisis es extremadamente lento.
Aquí se demuestra un método para liberar las células de los andamios en 3D-por ejemplo, para el posterior análisis por citometría de flujo. En este protocolo las células progenitoras neurales (hNPCs) de la línea celular ReNcell VM (Millipore EE.UU.) se cultivaron y se diferencian en 3D andamios que consiste en PuraMatrix (PM) o PuraMatrix complementado con la laminina (PML). En nuestras manos un PM-concentración de 0,25% fue óptimo para el cultivo de las 13 células, sin embargo, la concentración puede ser adaptado a otros tipos de células. 12 Las células liberadas pueden ser utilizados para, por ejemplo estudios inmunocitoquímicos y posteriormente analizados por citometría de flujo. Esto acelera el análisis y la movolver otra vez, el resto de datos obtenidos sobre una base más amplia, la mejora de la fiabilidad de los datos.
Protocol
1. Parte 1: Cultura de hNPCs en PuraMatrix
- De antelación a la generación de un andamio con una concentración de 0,25% PuraMatrix sin laminina que se necesita para preparar las siguientes soluciones
- Prepare una solución de sacarosa al 20% y una solución que contenga 10% de sacarosa disuelta en agua destilada estéril.
- Para la solución de una mezcla de 120 l de la solución de sacarosa al 20% con 120 l de agua destilada en un tubo de 1,5 ml cónico.
- Para la solución de dos mezcla de 60 l de la solución PuraMatrix con 60 l de solución de sacarosa al 20% en un tubo de 1,5 ml cónico.
Para una preparación de un andamio con una concentración de 0,25% PuraMatrix complementado con la laminina (8 mg por cada 100 l Matrix) que se necesita para preparar las siguientes soluciones.
- Para la solución de una mezcla de 72 l de agua destilada con 120 l de solución de sacarosa al 20% y 48 l laminina en un tubo de 1,5 ml cónico.
- Para la solución de dos mezcla de 60 ml con solución PuraMatrix 60 l de la solución de sacarosa al 20% en un tubo de 1,5 ml cónico.
- Para el empotramiento de las células en el PuraMatrix preparar un plato de 4 celdas, y la cultura y el lugar de una hoja de cubierta de vidrio esterilizado (diámetro 13 mm) en dos pozos. Guarde la placa en la mesa de trabajo limpia para el uso posterior. Cubierta de cristal se desliza sólo se utilizan para los estudios inmunocitoquímicos. Si no tinciones inmunocitoquímicas se pretende, el paso se puede omitir.
Para preparar el hNPCs para la encapsulación de un andamio en 3D tiene que preparar las siguientes soluciones. Diluir el Benzonase en la solución de tripsina / EDTA, utilizando un factor de dilución de 1:10.000. Para una mezcla de la solución Trypsin-Inhibitor/Benzonase: DMEM/F12 + Benzonase 25U/μl + 1% HSA + inhibidor de tripsina (0.5mg/ml).
- Separar las células añadiendo 500 l de tripsina / Benzonase solución e incubar durante 5 minutos en una incubadora (37 ° C CO, 5% 2). Detener la reacción con una solución de Trypsin-Inhibitor/Benzonase. Posteriormente centrifugar las células separadas por 5 min a 3000 x g. Lavar las células con 5 ml de solución de sacarosa al 10% y se centrifuga de nuevo. Eliminar el sobrenadante.
- Resuspender las células en una solución de sacarosa al 10%, la solución final debe contener células 1x10 6 células / ml.
Los próximos pasos, desde 1,8 hasta 1,11, debe hacerse lo más rápido posible, debido a el bajo pH de la solución PuraMatrix, lo que podría ser perjudicial para las células.
- Mezcla de 60 l de suspensión de células con una solución de 1.
- Añadir 120 l de solución 1, que contiene las células, para el tubo cónico con una solución de 2 y mezclar cuidadosamente.
- Colocar 100 l de la mezcla de inmediato en cada cubierta se desliza residía en la placa de 4 pocillos.
- Agregar lentamente 200 l medio de cultivo de células por pozo y después de 2-3 minutos otro l 200. Esto iniciará el auto-ensamblaje de la matriz.
- Incubar ccodos a 37 ° C, durante 1 hora en la mesa de trabajo limpia en una placa de calefacción o de la zona caliente de la mesa de trabajo limpia. Medida de lo posible no mover la placa, ya que podría dañar el montaje de las matrices.
- Eliminar la mayor parte del medio, pero no todos, para evitar la caída de las matrices seco, con una pipeta de 1000 microlitros. Añadir 500 ul de medio de lavado de matrices durante 10 minutos. Finalmente se elimina el medio y añadir 500 l medio fresco y el lugar de la placa de cultivo en un incubador (37 ° C CO, 5% 2). Como las matrices son sensibles al choque de las placas se debe mover lo menos posible y se almacena, si es posible, en un aparte incubadora.
- El hNPCs aquí utilizados fueron proliferado durante 7 días en los andamios 3D-y la diferenciación se inició con la retirada de los 13 factores de crecimiento. Medio se cambió cada 2-3 días.
2. Parte 2: tinción inmunocitoquímica de las matrices de todo
- Con antelación al procedimiento de tinción que se necesita para preparar: abtampón de bloqueo solución que consta de suero de cabra normal de 5% y el 0,3% de Triton X-100 (disuelto en PBS, una solución de paraformaldehído al 4% sobre la base de PBS 0,1 M y si es necesario una solución con 4 ',6-Diamidin-2'-phenylindoldihydrochlorid DAPI) para una tinción de núcleos con DAPI 100 ng / ml disuelto en PBS. Las muestras fueron montadas con una mezcla de Mowiol y DABCO.
- Para lavar las matrices de eliminar el medio con una pipeta de 1.000 l, y lavar los andamios de una vez con PBS durante 5 minutos.
- Para solucionar los andamios eliminar el PBS y añadir 400 l de paraformaldehído (4% en PBS 0,1 M) a cada pocillo e incubar las matrices durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los andamios fijos se pueden almacenar en PBS suplementado con 0,02% NaN 3 a 4 º C durante varias semanas hasta varios meses.
- Antes de una tinción de lavar los andamios con PBS durante 5 minutos.
- Incubar los andamios en el bloqueo de la solución tampón. Solución de bloqueo se ha cambiado tres veces cada 2-3 horas y subsequently andamios se incubaron en solución de bloqueo durante la noche a 4 ° C.
- Eliminar la solución tampón de bloqueo y añadir el anticuerpo primario disuelto en PBS suplementado con suero de cabra 1% de lo normal y se incuban las matrices durante la noche a 4 ° C.
- Eliminar la solución de anticuerpo primario y lavado de andamios 4 veces durante 2 horas y, posteriormente, durante la noche a 4 ° C con PBS.
- Retire la PBS y la solución con el anticuerpo secundario, se disolvió en PBS suplementado con suero de cabra 1% de lo normal, durante 4 horas a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Lavar las muestras con PBS 4-6 veces durante 1 hora y, posteriormente, durante la noche a 4 ° C en la oscuridad.
- Para una tinción nuclear se puede añadir 400 l de la solución de DAPI por 30 min.
- Para montar las muestras que se necesita el microscopio. Añadir 50 l Mowiol / Dabco en el portaobjetos de microscopio. Quite la cubierta se desliza desde la placa de 4 bien y ponerlos cuidadosamente en el medio de montaje.
- Aquí se utilizó un 8000 Biozeromicroscopio (Keyence, Alemania, Karlsruhe) para obtener micrografías individuales y z-pilas. Cada pila contiene 30 fotografías individuales a una distancia de 1.2 micras. Utilizando el software del analizador correspondiente la falta de definición inherentes a la fluorescencia se retiró antes de proyecciones completas de la z-pilas se produjeron.
3. Parte 3: La liberación de hNPCs de los andamios para el análisis de citometría de flujo
- De antelación a la liberación de las células de los andamios lavar los andamios con 500 l HBSS.
- La transferencia de los andamios por medio de una pipeta de 1.000 l de un tubo cónico de 15 ml que contienen medio de cultivo celular.
- Para interrumpir los andamios mecánica resuspender la solución de células varias veces con una pipeta de 1.000 l, y posteriormente centrifugar la solución a 3000 xg durante 5 min.
- Eliminar el sobrenadante con una pipeta, añadir 500 l de tripsina / Benzonase solución y resuspender el pellet celular veces varios.
- Se incuban las células durante 5 minutosa 37 ° C en la solución de tripsina / Benzonase. Para detener la reacción añadir una solución Trypsin-inhibitor/Benzonase ml y pipeta de arriba y abajo varias veces.
- Se centrifuga la suspensión celular de 5 minutos a 3000 xg, separar el sobrenadante y lavar las células con 2 ml buffer HBSS. Repita este paso dos veces. Este procedimiento será eliminar los restos de la matriz.
- Pasar la suspensión celular a través de un colador solución de células (tamaño de poro 70 micras) para eliminar los agregados y recoger las células en un medio de cultivo celular. Las células obtenidas se pueden sembrar de nuevo por ejemplo, en la cubierta se desliza por los estudios funcionales como patch clamp o mediciones fluometric. Para procesar las células para citometría de flujo, fijar las células de inmediato (ver 4.1).
4. Parte 4: Cuantificación de células tubulina βIII positivos por citometría de flujo
- Fijar las células lanzado obtenido en el paso 3.7 con 1% PFA durante 15 min a temperatura ambiente.
- Se centrifuga la suspensión celular durante 5 minutos a 3000 xg y Remove el sobrenadante. Si es necesario, las células pueden estar preparados para ser almacenados a 4 ° C para su posterior análisis. Por lo tanto, suspender las células en tampón de lavado (PBS suplementado con BSA al 0,5% y 0,02% de Na-azida).
- Para continuar con la preparación para la citometría de flujo, se centrifuga la suspensión celular durante 10 minutos a 350 xg, descartar el sobrenadante y resuspender las células en 25 l de la solución de anticuerpos. Por lo tanto, el primer anticuerpo se mezcla con el tampón de saponina en una concentración de 1:100, por ejemplo βIII-tubulina. El búfer de saponina consiste en PBS con una concentración del 0,5% de saponina, una concentración de BSA del 0,5% y una concentración de Na-azida de 0,02%.
- Incubar la suspensión de células con el primer anticuerpo durante 2 horas a temperatura ambiente en un agitador. Como control negativo preparar una muestra sin el primer anticuerpo.
- Para la etapa de lavado primero añadir 300 l de amortiguación saponina directamente a las células. Se centrifuga la suspensión celular durante 5 minutos a 350 x g. Para la etapa de lavado en segundo lugar, descartarel sobrenadante, añadir 300 l de amortiguación y centrifugar la suspensión celular durante 5 minutos a 350 x g.
- Eliminar el sobrenadante y añadir 25 l solución que contiene el anticuerpo secundario (por ejemplo, Alexa Fluor 647, 1:1000, se disolvió en un tampón de saponina). Se incuban las células con el anticuerpo secundario 1h a temperatura ambiente, en la oscuridad.
- Para la etapa de lavado primero añadir 300 l de amortiguación saponina directamente a las células. Se centrifuga la suspensión celular durante 5 minutos a 350 x g. Para la etapa de lavado en segundo lugar, descartar el sobrenadante, añadir 300 l de amortiguación y centrifugar la suspensión celular durante 5 minutos a 350 x g.
- Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 500 l de solución de lavado para el análisis de citometría de flujo.
5. Resultados representante
Un ejemplo de hNPCs cultivadas en el auto-montaje de andamios PuraMatrix hidrogel se muestra en la figura 1. El hNPCs crecer en estructuras esféricas, como en el PM sin modificar. En esta condición la culturas, las células no pueden ser reconocidos en una transmisión de luz, a pesar de los paquetes de los procesos entre las esferas son visibles (fig. 1A). Dependiendo de las condiciones de cultivo del tipo de células utilizadas, la matriz se pueden modificar por ejemplo, mediante la adición de la laminina. Para la línea celular hNPC ReNcell VM (Millipore) laminina es necesaria para inducir un patrón de crecimiento de los agregados menos denso, pero una distribución más homogénea de las células (fig. 1B). Independiente de las modificaciones, la matriz se puede utilizar para estudiar la diferenciación neuronal, por ejemplo. Figura 1C presenta una coloración de la hNPCs para el marcador neuronal βIII-tubulina. En este ejemplo, las células fueron cultivadas durante 7 días en la matriz y, posteriormente, diferenciados por 4 días, donde la diferenciación fue inducida por la retirada de la FGE y factores de crecimiento bFGF. 13 cuerpos celulares y una densa red de procesos construidos por las células puede ser fácilmente reconocible. Sin embargo, es evidente que la cuantificación del número de células es mucho tiempo, como un gran número deimágenes de las diferentes regiones de la matriz tiene que ser analizado, para obtener una base de datos fiable para un análisis estadístico. En la figura 1D se puede ver un ejemplo de las células de liberados de la matriz y, posteriormente, platted en cubreobjetos. Estas células podrían ser utilizados para estudios funcionales.
La liberación de las células de los andamios 3D ofrece la posibilidad de analizar diferentes parámetros como la expresión de proteínas marcadoras o tasa de supervivencia de las células por AnnexinV / PI tinción o un ensayo de TUNEL. La figura 2 muestra un ejemplo de un análisis de citometría de flujo del porcentaje de células + βIII-tubulina. El control negativo (células que no están marcados para βIII-tubulina) se muestra en la figura 2A. Estos controles se utilizan para determinar la puerta para la detección posterior de + βIII-tubulina células (Fig. 2B). Una comparación de un conteo manual de las células y un análisis por citometría de flujo se muestra en la figura 2C. El porcentaje de células + tubulina βIII-se determexaminado por el recuento del número total de células (por medio de una tinción nuclear con DAPI) y el número de βIII-tubulina + en las células imágenes de fluorescencia.
Figura 1. hNPCs cultivadas en el péptido PuraMatrix auto-montaje de hidrogel. hNPCs A) encapsulado en PuraMatrix (PM) crecen en estructuras esféricas, densa llena, donde el diámetro de las esferas puede ser de hasta varios cientos de micras. En medio de las esferas se pueden reconocer los paquetes de procesos construidos por las células (flechas). B) Las células encapsuladas en PuraMatrix complementado con la laminina (PML) crecen en las estructuras menos densas, más homogéneamente distribuida. En la laminina complementado matriz se pueden reconocer las células individuales en las zonas menos densas (flechas), sin embargo, no es posible cuantificar el número de células. C) hNPCs diferenciadas por 4 días en PML marcador neuronal expresar como βIII-tubulina (verde). De evaluaciónte el porcentaje de células positivas que uno tiene que determinar el número total de células por una tinción nuclear como DAPI (azul). La microfotografía presenta la proyección completa de un z-stack de fotografías tomadas con microscopio Biozero-8000. D) Las células liberados de la matriz pueden ser sembradas en cubreobjetos por ejemplo, para estudios funcionales. La microfotografía muestra células en cultivo para 3d, posteriormente el procedimiento de liberación. La tinción de βIII-tubulina (rojo) muestra una morfología similar a las células alojadas en el andamio 3D.
Figura 2. El flujo de células análisis por citometría de liberado de PuraMatrix. Para superar la cuantificación de tiempo de microfotografías se utilizó un protocolo para liberar las células cultivadas en PuraMatrix que da acceso a un análisis más rápido por citometría de flujo. A las células) sin teñir fueron utilizados como control negativo, para fijar la puerta (marco negro) para el análisis posteriormentepor ejemplo, de la tubulina βIII las células. B) Para cuantificar el porcentaje de βIII-tubulina + células se utilizó la misma puerta, situada en el control negativo,. Células positivas aparecen en la parte derecha del eje x, donde también se observó una población intermedia (marco de puntos), más probable es que los desechos que representan a la célula. C) La comparación de manual de células contadas y células contadas por citometría de flujo reveló una proporción mucho mayor de células positivas, donde la dependencia del tiempo de la cantidad de βIII-tubulina + fue similar, lo que indica la fiabilidad del protocolo de citometría de flujo.
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Discussion
El uso de andamios 3D ofrece la oportunidad de estudiar el desarrollo de diferentes tipos de células en una situación de cultivo celular más cercana a la situación in vivo. Sin embargo, en relación con el análisis de la diferenciación neuronal por ejemplo, o estudios funcionales que uno tiene que superar algunos obstáculos para obtener datos fiables para la cuantificación por ejemplo, de tipos de células.
Aquí se describe la cultura de hNPCs en el hidrogel basado en péptidos andamios PuraMatrix y posteriormente la liberación de las células que se utilizarán para los estudios en una situación en 2D proporciona un fácil acceso a herramientas como FACS o ensayos funcionales. Recientemente hemos demostrado la influencia de la concentración PuraMatrix en la formación de los andamios en 3D mediante microscopía de fuerza atómica y la influencia sobre la supervivencia y diferenciación de las células. 13 Sin embargo, hay que tener en cuenta que cada tipo de células pueden necesitar diferentes culturas condiciones o matrices que consta de otros materiales, por ejemplo matrigEl o colágeno.
El protocolo para liberar las células se basa en un protocolo proporcionado por el fabricante de 18 años y es comparable con los protocolos utilizados para preparar por ejemplo, cultivos primarios de neuronas donde se aplica un aislamiento mecánico de las células por una digestión de la materia circundante por las enzimas. Las células de tolerar este procedimiento y la estancia vital y desarrollado procesos y expresan marcadores neuronales como βIII-tubulina, una vez que se siembran de nuevo en una superficie recubierta laminina. Aquí hemos realizado estudios de citometría de flujo con células lanzado para cuantificar la cantidad de células + tubulina βIII. La comparación con una cuantificación hacer "a mano" por el recuento de células en las micrografías revelaron una proporción mucho mayor de células + βIII-tubulina. Esto es más probable debido al mayor número de células contadas por el citómetro de flujo (50.000 por la sonda) en comparación con el análisis manual (varios cientos por sonda). Sin embargo, la cinética de la cantidad de & beta, III-tubulina + células sigue el mismo patrón en ambas muestras, donde se detecta una disminución de + βIII-tubulina células en el tiempo. Esto está de acuerdo con los estudios que utilizan las células ReNcell VM 15-17. Otros obstáculos que superar durante un análisis manual son zonas muy densas de las matrices que no pueden ser analizados o un fondo elevado del material de la matriz que resulta en una subestimación de la "real" el número de células. Estamos convencidos de que este protocolo puede ser adaptado a otros tipos de células que proporciona un método rápido y fiable para cuantificar varios aspectos de la proliferación, diferenciación y supervivencia de las células.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Norman Krüger por su excelente apoyo técnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PuraMatrix peptide hydrogel | BD Biosciences | 354250 | |
| Mouse laminin I | Cultrex | 400-2009090 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378-1KG | |
| Normal goat serum | Dako | X0907 | |
| Triton X 100 | Carl Roth Gmbh | 3051.3 | |
| PBS Dulbecco | Biochrom AG | L 1825 | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170-088 | Hanks’ Balanced Salt Solution 1X |
| βIII-tubulin antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-51670 | Mouse, monoclonal, 1:500 |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A 11029 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A 11031 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A 21235 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Aldrich | D2,780-2 | 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane 98% |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352350 | 70 μm pore size |
| Saponin | Merck & Co., Inc. | 7695 | |
| Trypsin/ EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
| Benzonase 250 U/μl | Merck & Co., Inc. | 1.01654.0001 | |
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 (500 mg) | |
| 20% HSA | Octapharma | Human-Albumin Kabi 20% |
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