Summary
Verfahren zur Kultur von Endothelzellen eine Monoschicht der gesamten inneren Oberfläche des 3D einer Mikrofluidikvorrichtung mit mikrovaskulären großen Kanälen (<30 um) beschrieben. Dies
Abstract
Advances in Mikrofabrikationstechniken haben die Produktion von kostengünstigen und reproduzierbaren mikrofluidischen Systemen für die Durchführung von biologischen und biochemischen Experimenten auf der Mikro-und nanoskaligen 1,2 aktiviert. Darüber hinaus haben Mikrofluidik ebenfalls speziell verwendet, um quantitativ zu analysieren hämatologischen und mikrovaskulären Verfahren, wegen ihrer Fähigkeit, eine einfache Steuerung der dynamischen Strömungsumgebung und biologischen Bedingungen 3-6. Als solche haben die Forscher in jüngerer Zeit mikrofluidischen Systemen verwendet werden, um Blutkörperchen Verformbarkeit, Blutkörperchen Aggregation, mikrovaskuläre Blutfluss und Blutkörperchen-Endothelzell-Interaktionen 6-13 studieren. Allerdings sind diese mikrofluidischen Systemen entweder gar nicht zählen kultivierten Endothelzellen waren größer oder als die sizescale relevanten mikrovaskulären pathologischen Prozessen. Ein mikrofluidischen Plattform mit kultivierten Endothelzellen, dass genau rekapituliert die zelluläre, physikalischen und hemodynAmic Umfeld der Mikrozirkulation wird benötigt, um unser Verständnis der zugrunde liegenden biophysikalischen Pathophysiologie von hämatologischen Erkrankungen, die eine erneute Mikrovaskulatur.
Hier berichten wir über eine Methode, um eine "endothelialisierten" In-vitro-Modell der Mikrovaskulatur erstellen, mit Hilfe eines einfachen, einzigen Maske Mikrofabrikationsprozessen in Verbindung mit Standard Endothelzellkultur Techniken, zu pathologischen mikrovaskulären biophysikalischen Interaktionen, die in hämatologischen Erkrankungen auftreten, zu studieren. Diese "Mikrovaskulatur-on-a-Chip" bietet die Forscher mit einem robusten Assay, die eng kontrolliert biologischem sowie biophysikalischen Bedingungen und wird mit einer Standard-Spritzenpumpe und Hellfeld / Fluoreszenzmikroskopie. Parameter wie mikrozirkulatorischen Vorraussetzungen, Endothelzellen Typ, Blut Zelltyp (en) und Konzentration (en), Arzneimittel / Hemmkonzentration usw., sind bequem gesteuert. Als solche bietet unser Mikrosystemtechnikeine Methode, um quantitativ zu untersuchen Krankheit Prozesse, in denen mikrovaskulären Flusses aufgrund der Veränderungen von Zell-Adhäsion, Aggregation und Verformbarkeit, eine Fähigkeit, nicht verfügbar mit den bestehenden Assays beeinträchtigt wird.
Protocol
1. Fabrication der endothelialen Microdevice
- Erstellen Sie eine Photomaske durch die Vorlage eines computerunterstützten Konstruktion (CAD) Zeichnung des Mikrofluidik-Vorrichtung an einen externen Anbieter Maske. Die verwendete Maske wurde von einer Chromschicht auf Kalk-Natron-Glas besteht. In diesem Fall wird Mikrofluidkanal Breite betrug 30 um.
- Reinigen einer nackten Silizium-Wafer mit Piranha (10:1 Verhältnis von Schwefelsäure und Wasserstoffperoxid) für 15 Minuten und tauchen in Flusssäure für 30 Sekunden. Spülen mit deionisiertem Wasser (DI) für ca. 10 Sekunden.
- Verwendung eines Spin-Coater, Spin Microchem SU-8-2025 Photoresist auf den Wafer zu einer Höhe von 30 um. Für SU-8 2025, ist ein Spin Drehzahl von 3000 min empfohlen. Andere Viskositäten von SU-8 zur Verfügung, wird diese Höhe zu erreichen. Eine vollständige Anleitung für SU-8-Einsatz sind verfügbar unter www.microchem.com
- Setzen Sie den Wafer mit SU-8 auf einer Heizplatte bei 95 ° C für5 Minuten zu verjagen überschüssiges Lösungsmittel.
Hinweis: Ein Ofen wird der Wafer anders trocknen als eine Kochplatte und wird nicht empfohlen. - Platzieren Sie eine Maske mit dem gewünschten Feature Form über den Wafer, und UV-Licht bestrahlen (160 mJ / cm 2 gemessen bei 365 nm) in einem Mask Aligner (Karl Süss, MA-6). Dieses Kreuz verbindet den Fotolack.
- Legen Sie die Wafer-Rückseite auf einer Heizplatte bei 95 ° C für weitere 5 Minuten weiter beschleunigen die Polymerisation von SU-8.
- Tauchen des Wafers in SU-8-Entwickler, in erster Linie aus PGMEA (Propylenglykolmethylether Acetat) für 4 Minuten zusammen, um den nicht-vernetzten SU-8 zu entfernen.
- Spülen Sie die neu entwickelten Wafer mit 100% Isopropylalkohol (IPA) für 10 s. Der Wafer kann dann unter Verwendung unter Druck stehendem Stickstoff oder indem man das Lösungsmittel aus der Wafer in einem sauberen Abzug, der für mehrere Minuten zu verdampfen.
- Band die Ränder des getrockneten Wafer mit strukturiertem SU-8 in eine Petrischale vorabentlüften Bewegung.
- Bewerben 1 mL Sigmacote auf dem Wafer mit einer Pipette, decken mit der Spitze der Petrischale, und wirbeln Wafer, um eine vollständige Beschichtung der Wafer sicherzustellen, Deckel abnehmen und erlauben Wafer für einige Minuten trocknen lassen, bis alle Lösungsmittel verdampft ist.
2. PDMS (Polydimethylsiloxan) Herstellung
- Mix PDMS Polymer und Härter im Verhältnis 10:1 (w / w) und Luftblasen mit einem Vakuumexsikkator getrocknet. Die erforderliche Zeit zum Entgasen des PDMS variiert je nach der Stärke des zur Verfügung Vakuumsystem, jedoch typischerweise im Bereich von mehreren Minuten bis eine Stunde. Für ein sechs Zoll Petrischale ohne zuvor ausgegossenen PDMS ist ein Gesamtvolumen von 60 ml des Polymers wird empfohlen.
- Die Mischung auf den Wafer, etwa 5 mm dick. Auch auf einen flachen Teller gießen unten auf eine dünne Folie aus PDMS zu schaffen, etwa 1 mm dick. Härten bei 60 ° C in einem Ofen über Nacht.
- Mit einem Messer oder Skalpell ausgeschnitten rund um die cured PDMS-Gerät und entfernen Sie sie aus dem Wafer. Darüber hinaus schneiden eine dünne Folie aus PDMS geringfügig größer als der Vorrichtung.
- Erstellen Sie Ein-und Auslass Löcher in der PDMS-Gerät mit einem 1,0 mm Lochung. Dies kann unter Verwendung entweder einen Stift Laster, Harris Uni-Core oder ähnlichen Vorrichtung.
- Reinigen Sie die Oberflächen des Gerätes und das Blatt mit Tesafilm.
- Verwendung einer Plasma-Reiniger, freizulegen die Oberflächen der Vorrichtung und PDMS PDMS Datenblatt an Sauerstoffplasma für 30 s. Die Sauerstoff-Plasma erzeugt reaktiven Spezies auf der freiliegenden Oberfläche des PDMS, die darstellt, wenn in körperlichen Kontakt gebracht.
- Verbinden kleiner Schlauch mit einer geringen Länge (einige Zentimeter) mit großem Schläuche, die wiederum mit einer Spritze mit einer stumpfen-Punktnadel verbunden ist, mit 50 ug / ml Fibronectin aus Humanplasma in PBS gefüllt. Der Schlauch und die Nadel sind so bemessen, dass ein Reibschluss zwischen dem Rohr erzeugt wird. Legen kleinere Rohre mit dem Einlass des PDMS und eine Mikrovorrichtungpply Druck auf der Spritze, um die Kanäle ganz mit Fibronectin-Lösung und einen kleinen Tropfen 100 ul an der Auslaßöffnung zu schaffen, um sicherzustellen, dass die Kanäle nassen bleiben. Inkubieren Sie das Gerät bei 37 ° C für 40-60 min.
- Schließen Sie eine frische Spritze mit PBS auf die stumpfe Spitze Nadel gefüllt. Üben Sie Druck auf die Spritze, um das Gerät mit PBS spülen.
3. Seeding der Mikrofluidik-Vorrichtung mit Endothelzellen
- Planen 1.000.000 Zellen / ml menschlichen Endothelzellen der Nabelvene (HUVECs) in endothelialen Wachstumsfaktor Medien mit 8% Dextran. Ein Bereich von 500.000 bis 2.000.000 Zellen / ml wurde erfolgreich verwendet. Die Zugabe von Dextran in die Zelle Ladehilfsmittel erhöht die Viskosität des Fluids, das die Geschwindigkeit von Endothelzellen abnimmt, wenn sie die Fibronectin-beschichteten mikrofluidischen System eingeben. Dies wiederum erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass die Zellen anhaften und Kultur erfolgreich in der Mikrovorrichtung.
- Cchließen Sie den neuen Spritze und Schlauch, wie in Schritt 2.7. jedoch mit einem längeren Schlauch (ca. 1 Meter in der Länge).
- Um die Leistungsfähigkeit dieses Systems zu optimieren, ist es wichtig, an dieser Stelle auf eventuelle Lecks oder Blasen in der gesamten Perfusion Systems zu verhindern, jedes Austreten von Lösung oder das Vorhandensein von Blasen in den Medien wird die Strömung verändern und verhindern, dass erfolgreiche Aussaat der Endothelzellen. Daher ist eng anliegend des Schlauchs wesentlichen um eine Leckage zwischen allen Anschlüssen zu beseitigen. Blasen, die in der Spritze und / oder der Schlauch zu machen, bevor Zellen in der Mikrovorrichtung eingeführt werden und die gesamte Perfusionssystem sollte mit der Zelle Lösung vor dem Anbringen des Schlauchs mit der mikrofluidischen, um die Einführung von Luftblasen zu vermeiden grundiert werden.
- Verwendung einer Spritzenpumpe infundieren Zellsuspension in PDMS Gerät Volumenstrom von 1,23 ml / min für 2 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2. Optimale Ergebnisse wurden erzielt, wenn die Spritzenpumpe war beim gleicher Höhe wie der PDMS-Gerät. Für den Zulauf sorgt die längeren Schlauch, der innerhalb des Inkubators werden kann gewickelt, dass die Zellen und Medien ausreichend sind, bevor er in Kontakt mit der Vorrichtung erwärmt. In unserem System nähert sich die volumetrische Strömungsrate von 1,23 ml / min ein Midstream Geschwindigkeit von ~ 1 mm / s in den kleinsten Mikrokanäle, entsprechend einer Wandschubspannung ~ 1 Dyn / cm 2 bei dieser Kanäle mit Vollblut.
- Mit der gleichen Spritzenpumpe und lange Schläuche, perfuse frische Nährböden für 2-8 Tage bei-Verhältnis von 1,23 ml / min. Eine erfolgreiche Gerät wird eine Monoschicht von Endothel-Zellen, die auf der Innenseite der Vorrichtung innerhalb von 24-48 Stunden. Frühere Experimente haben gezeigt, dass konfluente Monolayer angemessen äußern VE-Cadherin an Zell-Zell-Verbindungen in der gesamten Einrichtung 14.
- Injizieren von Blut oder Zellsuspension in das System für Experimente.
4. Repräsentative Ergebnisse
_content "> Unter Verwendung dieses Protokolls Standard lithographischen Mikrofertigungstechniken verwendet werden, um die Form benötigt, um die mikrofluidischen Kanälen, die physiologisch imitieren die sizescale des Mikrovaskulatur (Abbildung 1A) produzieren zu schaffen. Mit Hilfe eines optimierten Perfusionstechnik, Endothelzellen dann Saatgut und die Kultur konfluent gesamten Innenfläche des mikrofluidischen Systems innerhalb von 24-48 Stunden nach dem Aussähen der Zellen (1B). Da die Mikrofluidik-System transparent ist, kann die gesamte Mikrovorrichtung auf einem Hellfeld / Fluoreszenz-Mikroskops zum Abbilden und Datensammlung gespeichert.Unser System kann dann angewendet, um hämatologische Erkrankungen, die biophysikalischen Eigenschaften, wie zB Sichelzellenanämie, in dem die erhöhte Steifigkeit des sichelförmigen Erythrozyten und Leukozyten und Endothel-aberranten Haftung auf mikrovaskulärer Obstruktion beitragen verändert beinhaltet die Untersuchung werden. Eine klinisch zugelassenes Medikament, Hydroxyurea, lindert Symptome, sondern seine dDirekten Einfluss auf mikrovaskulären Flusses ist nicht bekannt. Unser Test berücksichtigt sowohl Zell-Adhäsion und Steifigkeit, und zeigt, dass Hydroxyurea deutlich bessert Strömung in Sichelzellanämie (Abbildung 2).
Sichelzellenanämie ist nur ein Beispiel einer Anwendung für die Mikrovaskulatur-on-a-Chip, wie dieses System ideal geeignet ist, jede hämatologischen Verfahren, bei dem Blutzellen miteinander interagieren und Endothelzellen in der Mikrovaskulatur studieren. Andere klinisch relevante Anwendungen sind entzündliche Erkrankungen, Sepsis / Lungenschädigung, thrombotische Mikroangiopathie, Malaria und Krebs Metastasen, während mehr Basisanwendungen Leukozyten Biologie und hämatopoetischen Stammzellen Zellbiologie, unter vielen anderen auch.
Abbildung 1. A) das Anfangskapital PDMS Mikrofluidikvorrichtung vor Endothelialisierung. Hier wird die Mikrovorrichtung nämlich injizierth Lebensmittelfarbe sizescale und der Gesamtaufbau des Systems darzustellen. B) Hellfeldmikroskopie zeigt die Mikrofluidik-System ist komplett innerhalb von 48 Stunden Zellaussaat endothelialisiert unter Verwendung des Protokolls beschrieben.
Abbildung 2. A) Der Mikrovaskulatur-on-a-Chip mit Mikrokanälen in etwa der Größe der postkapillären Venolen (30 um), dem Ort der meisten Sichelzellenanämie mikrovaskulären obstruktiven Ereignissen. Vollblut aus Sichelzellanämie Patienten, die Hydroxyurea und von Patienten ohne Hydroxyurea wird durch zwei verschiedene Mikrovaskulatur-on-a-Chip-Geräte geflossen. B) Vollblut aus Sichelzellanämie Patienten, die Hydroxyurea Strömungen mit relativer Leichtigkeit in den endothelialisierten Mikrokanäle. C) Unter den gleichen Vorraussetzungen, Vollblut aus Sichelzellanämie Patienten ohne Hydroxyharnstoff zeigt jedoch viel mehr träge Strömung mit microchAnnel Obstruktion. Der untere Kanal vollständig mit keiner Strömung behindert und die Strömungsgeschwindigkeiten in den anderen endothelialisierten Mikrokanäle sind deutlich geringer als in der Hydroxyharnstoff Zustand. Der Balken in allen drei Bildern ist 30 um.
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Discussion
Unsere endothelialisierten Kleinstgerätes System eignet sich am besten in Verbindung mit in-vivo-Experimenten verwendet und seine reduktionistische Ansatz kann dazu beitragen, Aufklärung der biophysikalischen Mechanismen von hämatologischen Prozesse, die beim Menschen und im Tiermodell beobachtet werden. Darüber hinaus ist unser System nicht ohne Einschränkungen. Zum Beispiel sind unsere mikrofluidischen Kanälen im Querschnitt quadratisch. Obwohl technisch kreisförmigen Mikrokanäle 10,11 hergestellt werden können, entschieden wir uns, um einen vereinfachten und Standard-Fertigung Verfahren zu verwenden, damit andere Forscher zu leicht wenden dieses System, um ihre eigene Arbeit. Darüber hinaus ermöglicht das Vorhandensein der kultivierten Endothelzellen von Natur aus "rundet" die wirksame Lumen, das System auf mehrere physiologische. Darüber hinaus zeigen unsere Fluid-dynamische Modellierung, dass die Strömungsverhältnisse in unserem System vergleichbar mit der in der in vivo Mikrovaskulatur sind. Schließlich Charakterisierung jüngsten Arbeiten Blutfluss im Quadrat eind rechteckigen Mikrokanäle hat gezeigt, dass diese Geometrien für Blutrheologie Versuche 15 sind.
Schließlich wird unser Test nicht dazu gedacht, zu messen, der Isolierung, der unterschiedlichen zellulären biophysikalischen Eigenschaften, die mikrovaskuläre Okklusion führen. Techniken wie Rasterkraftmikroskopie, Mikropipette Aspiration und optische Fallen sind gut für diese Art von Experimenten geprägt. Stattdessen ist der Wert der Mikrosystem seine Fähigkeit zu rekapitulieren, gleichzeitig und in einer einzigen in vitro-System, ein Ensemble von physiologischen Prozessen und biophysikalischen Eigenschaften, einschließlich Expression von Adhäsionsmolekülen, aberrante Blutkörperchen-Endothel-Zell-Wechselwirkungen, Blutzellen Aggregation (zB Thrombose ), Zell-Verformbarkeit Zelle Größe / Form, mikrovaskuläre Geometrie und Hämodynamik, die alle zu pathologischen mikrovaskulären zellulären Interaktionen in verschiedenen Krankheitszuständen wirken.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken T. Hunt, M. Rosenbluth, und das Lam-Lab für ihre Ratschläge und nützliche Diskussionen. Wir erkennen die Unterstützung von G. Spinner und dem Institut für Elektronik und Nanotechnologie an der Georgia Institute of Technology. Finanzielle Unterstützung für diese Arbeit wurde durch ein NIH-K08 HL093360, UCSF REAC award, einem der NIH Nanomedizin Development Center Award PN2EY018244, und die Finanzierung aus dem Zentrum für Endothelial Cell Biology von Kinder-Healthcare von Atlanta zur Verfügung gestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| blunt point needle | OK International | 920050-TE | Precision TE needle 20 Gauge x 1/2", pink |
| dextran | Sigma-Aldrich | 31392 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Hole puncher (pin vise) | Technical Innovations | ||
| Human umbilical cord endothelial cells (HUVECs) | Lonza | CC-2519 | |
| Plasma cleaner | Plasma | PDC-326 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Fisher Scientific | NC9285739 | Sylgard 184 Silicone Elastomer KIT |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| SU-8 2025 | Microchem | Y111069 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3008 | PHD-ULTRA |
| tubing(larger) | Cole-Parmer Instrument Company | 06418-02 | Tygonreg microbore tubing, 0.020" ID x 0.060" OD |
| tubing(smaller) | Cole-Parmer Instrument Company | 06417-11 | PTFE microbore tubing, 0.012" ID x 0.030" OD |
References
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